靶向KITD816Y突变衍生新抗原的TCR及应用

本发明属于多肽药物和多肽疫苗领域，具体涉及靶向kit d816y衍生新抗原的特异性tcr及其在肿瘤免疫治疗中的应用。

背景技术：

1、kit基因编码干细胞因子受体scfr，是iii型酪氨酸激酶受体家族的一员。与二聚体分子scf结合后，c-kit蛋白可被激活导致自身磷酸化，从而介导细胞的增殖、迁移与分化，对于正常的造血、生殖、消化和神经系统等至关重要。

2、kit基因的功能获得突变可导致酪氨酸激酶活性增加，促进肿瘤发生和发展，已在多种实体和血液恶性肿瘤中被鉴定到，包括90％肥大细胞增多症、80％-90％胃肠道间质瘤、26％精原细胞瘤、10％-20％黑色素瘤和急性髓细胞白血病(aml)。其中，最常见并具有明确临床意义的突变位于外显子17，尤以d816位的突变最为多见，超过90％系统性肥大细胞增多症和一半以上t(8；21)aml患者中能检测到。相比于kit野生型和其他kit突变型，d816突变型患者具有更短的中位缓解期、高累积复发率和复发挽救治疗的低缓解率，预后明显更差。部分多靶点酪氨酸激酶抑制剂对kit基因突变有效，然而，仍有相当部分患者初始治疗无效，或出现继发耐药。因此，亟需研发kit d816突变的新型靶向疗法以改善疗效。

3、与直接靶向肿瘤细胞的传统化疗及靶向药物不同，肿瘤免疫疗法利用人体自身免疫系统，通过激活t、b细胞对肿瘤细胞产生持久的免疫反应。近年来，靶向肿瘤恶性变异衍生的新抗原的疗法成为免疫治疗的首选。新抗原仅在肿瘤中表达但在正常组织中不表达，被高度敏感且对其表位具有特异性的tcr直接识别，不引起中枢免疫耐受，具有免疫原性强、安全性好的优势，因此成为了基于t细胞的免疫疗法最理想的靶标。我们在前期研究已发现，kit常见的热点突变——kit d816y衍生的新抗原(多肽序列：yikndsnyv)具有高免疫原性，由人类白细胞抗原hla-a*02:01分子递呈至肿瘤细胞表面形成phla复合物，诱导t细胞活化并显著杀伤肿瘤细胞，是抗肿瘤免疫治疗的重要靶标。

4、t细胞免疫反应的启动依赖于tcr对抗原的识别。将抗原特异性tcr人工转导至t细胞构建的工程化tcr-t细胞，靶向杀伤肿瘤细胞，有望改变机体免疫抑制状态，诱导特异性免疫反应，促进机体免疫保护的良性循环。靶向新抗原的tcr-t细胞在先驱性临床研究中取得令人瞩目的抗肿瘤疗效，并且新抗原特异性tcr-t细胞在患者体内存续时间长，持续发挥免疫监视功能。然而，目前尚未有针对kit d816y的tcr-t细胞疗法。

5、基于kit d816y是免疫治疗良好靶标及t细胞对kit d816y突变的识别，靶向kitd816y突变衍生新抗原的替代方法包括利用tcr进行t细胞介导的免疫治疗，然而，天然tcr结构的人工转导，存在表达率低、错配率高等限制。因此需要开发亲和力增强的tcr突变体。

技术实现思路

1、本发明目的在于针对现有技术的不足，本发明提供了靶向kit d816y突变衍生新抗原的特异性tcr及其在肿瘤免疫治疗中的应用。

2、根据本发明目的的第一方面，提供一种靶向kit d816y突变衍生新抗原的特异性tcr，

3、所述kit d816y突变衍生的新抗原(多肽序列：yikndsnyv)，与hla-a*02:01分子结合并被递呈至目标靶细胞表面形成yikndsnyv-hla-a*02:01复合物。

4、所述yikndsnyv-hla-a*02:01复合物，被t细胞表面特异性tcr识别，诱导并启动特异性免疫反应。

5、所述tcr具有结合yikndsnyv-hla-a*02:01复合物的特性，所述tcr包含tcrα链可变区和tcrβ链可变区；

6、所述tcrα链可变区的cdr3氨基酸序列为caasgrvrdtnagkstf(seq id no:7)。

7、和/或所述tcrβ链可变区的cdr3氨基酸序列为csardglagswlheqyf(seq id no:10)。

8、优选的，所述tcrα链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

9、αcdr1：seq id no:5。

10、αcdr2：seq id no:6。

11、αcdr3：seq id no:7。

12、优选的，所述tcrβ链可变区的3个互补决定区氨基酸序列为：

13、βcdr1：seq id no:8。

14、βcdr2：seq id no:9。

15、βcdr3：seq id no:10。

16、优选的，以上所述的靶向kit d816y突变衍生新抗原的tcr，所述tcrα链可变区的氨基酸序列为与seq id no:1具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；和/或所述tcrβ链可变区为与seq id no:2具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。

17、优选的，所述tcr包含α链氨基酸序列seq id no:17。

18、优选的，所述tcr包含β链氨基酸序列seq id no:18。

19、优选的，所述tcr为αβ异源二聚体。

20、优选的，所述tcr的α链与β链之间含有人工链间二硫键。

21、优选的，所述tcr的氨基酸序列如seq id no:21所示。

22、本发明的第二方面。提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的tcr分子的核酸序列或其互补序列。

23、优选的，所述核酸分子包含编码tcrα链可变区的核苷酸序列seq id no:3。

24、优选的，所述核酸分子包含编码tcrβ链可变区的核苷酸序列seq id no:4。

25、优选的，所述核酸分子包含编码tcrα链的核苷酸序列seq id no:19。

26、优选的，所述核酸分子包含编码tcrβ链的核苷酸序列seq id no:20。

27、优选的，所述核酸分子包含核苷酸序列seq id no:22。

28、本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

29、优选的，所述的载体为病毒载体。

30、更优选的，所述的病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。

31、本发明的第四方面，提供了一种分离的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合由外源的本发明第三方面所述的核酸分子。

32、本发明的第五方面，提供了一种细胞，所述细胞表达本发明第一方面所述的靶向kit d816y突变衍生新抗原的tcr或其抗原结合片段，或携带本发明第二方面所述的多核苷酸，或含有本发明第三方面所述的载体。

33、优选的，所述细胞为t细胞、外周血单个核细胞(pbmc)或干细胞。

34、本发明的第六方面，还提供了所述的靶向kit d816y突变衍生新抗原的tcr或其抗原结合片段的制备方法，所述制备方法包括培养第五方面的细胞。

35、本发明的第七方面，还提供了本发明第一方面的靶向kit d816y突变衍生新抗原的tcr或其抗原结合片段，或本发明第二方面的多核苷酸，或本发明第三方面的载体，或本发明第四方面的细胞，或本发明第五方面的细胞，或本发明第六方面的制备方法在制备用于治疗白血病的药物中的应用。

36、本发明第八方面，还提供了一种用于治疗肿瘤的药物，所述药物包含本发明第一方面的靶向kit d816y突变衍生新抗原的tcr或其抗原结合片段，或第二方面的多核苷酸，或第三方面的载体，或第四方面的细胞，或第五方面的细胞。

37、本发明通过广泛而深入的研究，获得一种靶向kit d816y突变衍生新抗原的高亲和力tcr或其抗原结合片段，以及包含编码所述tcr的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子，以及含有所述核酸分子的载体，以及转导核酸分子或所述载体的细胞，以及包含所述tcr、核酸分子、载体或细胞作为活性成分的药物组合物，以及所述tcr、核酸分子、载体、细胞、药物组合物分别用于制备检测、预防/治疗肿瘤的药物的用途。

38、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

39、(1)本发明的tcr可直接通过精准靶向kit d816y突变清除肿瘤细胞；

40、(2)本发明的tcr体内蛋白表达量高且与内源性tcr链无错配；

41、(3)表达本发明tcr的t细胞杀伤能力强、特异性强，可以有效用于含有kit d816y突变的肿瘤的治疗。