一种靶向MICA的全人源抗体或抗体片段及其嵌合抗原受体和应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种靶向mica的全人源抗体或抗体片段及其嵌合抗原受体和应用。

背景技术：

1、自然杀伤(natural killer，nk)细胞是人体先天免疫(innate immunity)的重要组成部分，该类细胞可以不受mhc抗原呈递的限制，即可识别并杀死被细菌感染或转化为肿瘤的靶细胞，为肿瘤免疫过继性治疗提供即用型的细胞治疗药物。因此，通过基因改造的技术手段使nk细胞表达嵌合抗原受体(cars)融合蛋白，制备靶点特异性的car-nk细胞，在临床治疗中表现出更少的由细胞因子释放带来的免疫毒性，有着优于car-t细胞治疗的安全优势。同时，car-nk细胞的有限寿命，对正常细胞产生脱靶(on-target/off-tumor)毒性的风险大大降低。此外，它还能降低同种异体反应和移植物抗宿主病(gvhd)的风险，使car-nk细胞可以从多种来源产生，包括nk92细胞、外周血单核细胞(pbmc)、脐带血(ucb)和诱导多能性干细胞(ipsc)car-nk细胞，该疗法是针对实体瘤和血液系统恶性肿瘤的一种创新型癌症免疫疗法。

2、nk细胞的杀伤作用是需要通过识别靶细胞表面产生了更少的抑制性受体或更多的杀伤激活信号，而nk细胞表面特征性受体nkg2d(nk group 2member d)就是参与这一过程的受体之一。nkg2d与提供杀伤激活信号的应激蛋白结合来起作用，这些蛋白包括mica/b(mhc class ipolypeptide–related sequence a/b)和ulbps(unique long 16-bindingproteins)。该类蛋白的表达通常与细胞的细菌感染、癌细胞转化、基因组损伤相关，常见于血源肿瘤和各种实体肿瘤中如结肠癌、卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌和肝癌中，使其成为一种非常有潜力的治疗靶点。但是在癌症细胞中mica/b的表达经常受到翻译后修饰而下调——mica/b的胞外段被数种金属蛋白酶酶切，从而使癌变细胞逃逸免疫监控。而脱落的片段将以游离的形式存在于细胞间隙中与nkg2d结合，进一步地阻碍nk细胞的杀伤。国外已有以mica为靶标，抑制其脱落机制的抗体药物在研，但功效仍依托于nk固有的nkg2d识别，且有限于已脱落的mica干扰。

3、因此，构建一种特异性识别mica且能绕开固有nkg2d识别杀伤的car-nk制备和治疗方案是本领域亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种靶向mica的全人源抗体或抗体片段及其嵌合抗原受体和应用，基于本发明提供的嵌合抗原受体制备的car-nk细胞，能够高特异性识别nkg2d配体mica，解决现有靶向性治疗的脱靶毒性等技术问题。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种靶向mica的全人源抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含：重链可变区和轻链可变区；所述的重链可变区包括三个互补决定区：hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述的hcdr1的氨基酸序列包括seq id no：3所示的序列；所述的hcdr2的氨基酸序列包括seq id no：4所示的序列；所述的hcdr3的氨基酸序列包括seq idno：5所示的序列；

3、所述的轻链可变区包括三个互补决定区：lcdr1、lcdr2、lcdr3，所述的lcdr1的氨基酸序列包括seq id no：6所示的序列；所述的lcdr2的氨基酸序列包括seq id no：7所示的序列；所述的lcdr3的氨基酸序列包括seq id no：8所示的序列。

4、较佳地，所述抗体或抗体片段的mica结合结构域是scfv，所述scfv的氨基酸序列包括seq id no：1所示的序列，或与该序列具有95％-99％同一性的同功能序列。

5、较佳地，所述scfv的氨基酸序列包括对序列seq id no：1进行修饰而获得的序列，被修饰的氨基酸至少为一个、两个或三个但不超过30个。

6、较佳地，所述抗体或抗体片段的抗mica结合结构域是scfv，所述scfv的核苷酸序列包括seq id no：2所示的序列，或与该序列具有95％-99％同一性的同功能序列。

7、较佳地，所述scfv的核苷酸序列包括对序列seq id no：2进行修饰而获得的序列，被修饰的核苷酸至少为一个、两个或三个但不超过30个。

8、本发明还提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体含有上述的靶向mica的全人源抗体或抗体片段。

9、较佳地，所述嵌合抗原受体包含依次连接的：信号肽序列、mica结合结构域、检测标签、铰链区和跨膜结构域，以及功能性信号传导结构域：

10、所述的信号肽序列包含ef-1α，所述信号肽的氨基酸序列为seq id no：9所示的序列；

11、所述的检测标签包含c-myc，所述检测标签的氨基酸序列为seq id no：10所示的序列；

12、所述的mica结合结构域包含scfv，所述scfv包括所述的靶向mica的全人源抗体或抗体片段；

13、所述的铰链区和跨膜结构域包含：铰链区hinge tm和跨膜结构cd8，所述铰链区和跨膜结构域的氨基酸序列为seq id no：11所示的序列；

14、所述的功能性信号传导结构域包含：依次连接的4-1bb和cd3zeta，所述的4-1bb的氨基酸序列为seq id no：12所示的序列，所述的cd3 zeta的氨基酸序列为seq id no：13所示的序列。

15、本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的嵌合抗原受体。

16、较佳地，所述宿主细胞为nk细胞。

17、本发明还提供了一种慢病毒质粒，所述慢病毒质粒包含能够编码上述的靶向mica的全人源抗体或抗体片段的核苷酸序列。

18、本发明还提供了上述的靶向mica的全人源抗体或抗体片段、或嵌合抗原受体、或权宿主细胞、或慢病毒质粒在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为mica抗原过表达相关肿瘤。

19、相较于现有技术，本发明的有益效果至少包括：

20、(1)本发明提供的全人源抗体或抗体片段能够高特异性地与人源mica蛋白结合，ec50值为0.67nm。

21、(2)本发明提供的嵌合抗原受体能够靶向高表达mica的肿瘤细胞，利用嵌合抗原受体技术在nk细胞中工程化表达整合在car中的、结合mica的人源抗体片段，得到的嵌合抗原受体nk细胞能够用于治疗与mica抗原过表达相关的癌症。

技术特征：

1.靶向mica的全人源抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段包含：重链可变区和轻链可变区；

2.根据权利要求1所述的靶向mica的全人源抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段的mica结合结构域是scfv，所述scfv的氨基酸序列为seq id no：1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的靶向mica的全人源抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段的mica结合结构域是scfv，所述scfv的核苷酸序列为seq id no：2所示的序列。

4.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有如权利要求1-5中任意一项所述的靶向mica的全人源抗体或抗体片段。

5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含依次连接的：信号肽序列、mica结合结构域、检测标签、铰链区和跨膜结构域，以及功能性信号传导结构域；

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4或5所述的嵌合抗原受体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为nk细胞。

8.一种慢病毒质粒，其特征在于，所述慢病毒质粒包含能够编码权利要求1-3中任意一项所述的靶向mica的全人源抗体或抗体片段的核苷酸序列。

9.权利要求1-3中任意一项所述的靶向mica的全人源抗体或抗体片段、或权利要求4或5所述的嵌合抗原受体、或权利要求6或7所述的宿主细胞、或权利要求8所述的慢病毒质粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为mica抗原过表达相关肿瘤。

技术总结本发明公开了一种靶向MICA的全人源抗体或抗体片段及其嵌合抗原受体和应用。该靶向MICA的CAR‑NK细胞的制备方法包括如下步骤：噬菌体展示技术获得靶向MICA抗原的单链抗体，构建包含靶向MICA的单链抗体的嵌合抗原受体，使NK细胞表达CAR融合蛋白，得到靶向MICA抗原的CAR‑NK细胞；所述CAR融合蛋白包括靶向MICA的单链抗体、CD8铰链及跨膜区域、4‑1BB共刺激区域及CD3ζ胞内信号激活域。本发明的技术方案对于MICA高表达的实体肿瘤的治疗具有积极效果，具有重大的应用价值。技术研发人员：闵晨雨,周嘉怡受保护的技术使用者：常州费洛斯药业科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/26