一种利用精胺处理杂交鹅掌楸‘南林-金森E1号’提高转化效率的方法

本发明属于植物遗传转化，更具体地说，涉及一种利用精胺处理杂交鹅掌楸‘南林-金森e1号’提高转化效率的方法。

背景技术：

1、农杆菌介导的植物的遗传转化受到多方面的影响，只有在合适的转化条件下，外源dna才能够整合到植物基因组中并稳定表达。影响遗传转化的因素主要有侵染时间、共培养时间以及抗生素延迟筛选时间，优化好这些条件有利于建立高效的遗传转化体系。目前的研究通过农杆菌介导的方法，以杂交鹅掌楸外植体为材料，将携带天麻抗真菌蛋白(gafp)以及兔防御素(np1)的双价抗病基因的质粒转入杂交鹅掌楸。并且有研究对杂交鹅掌楸的相关转化影响因素进行研究后，得出了一套最佳的杂交鹅掌楸遗传转化方案，即取继代第15-20天的外植体，as的浓度为40mg/l，经过预培养2天后，将农杆菌的菌液浓度稀释到0.2-0.4之间，农杆菌的侵染时间为5-10min最佳，将侵染的杂交鹅掌楸材料共培养2天之后继代到筛选培养基上筛选培养。之后对得到的所有数据进行lsr比较得出，选择继代15-20天的杂交鹅掌楸外植体材料，使用as浓度为40mg/l预培养2天后进行转化，转化后进行2天的共培养，在这样的处理下能大大提高转基因的转化效率，而其他的一些因素对于转基因效率的提升没有明显的促进作用。也就是使用低浓度的农杆菌菌液以及相对较短的侵染时间能够使转基因材料后期更好的脱菌，利于细胞的遗传转化后的恢复和生长。利用上述转化体系，后来的研究以绿色荧光蛋白(gfp)基因为报告基因，将悬浮培养的胚性细胞作为受体材料进行遗传转化研究，成功获得了转化细胞。

2、多胺是一类生物胺，对大多数生物体的细胞起作用。多胺包括二胺腐胺(put)和更高的多胺，亚精胺(spd)和精胺(spm)。这三种胺经常被归为一类，通常被认为具有相似的生物学效应。多胺为含氮物质，从put(二胺)到spd(三胺)再到spm(四胺)，胺强度增加，它们作为“多胺”在细胞分裂和分化、细胞增殖、稳态、基因表达、大分子合成和细胞凋亡方面具有重要作用。多胺还与细胞伸长、体细胞和合子胚胎发生、根形成、花的萌发和发育、果实发育和成熟、花粉管生长和衰老以及生物和非生物胁迫反应。多胺在植物细胞中含量较高，而其中spm的丰度最低。多胺对细胞活力很重要，但是它们在细胞内的浓度受到严格调节。有研究显示，多胺调节番茄果实的发育过程；在培养基中掺入spm(15mg/l)，可提高西瓜中农杆菌介导的遗传转化效率。

3、杂交鹅掌楸(liriodendron hybrid)是鹅掌楸(liriodendron)和北美鹅掌楸(liriodendron tulipifera)的杂交种，其木材性状优良，是重要的用材树种，并且其适应能力强，具有较强的耐寒性。除此之外，其叶形独特，为马褂状，花朵艳丽为黄色，具有非常高的观赏价值，因此在园林中也有广泛应用。但杂交鹅掌楸自身繁殖能力差，其育种手段通常是人工杂交育种，受到季节和气候等因素限制，影响了其推广应用，因此，在过去二十多年的研究中，南京林业大学细胞工程团队建立了高效的杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生繁殖体系，对于该树种大规模的推广应用具有重要的意义。随着杂交鹅掌楸不断推广应用，利用基因工程和基因编辑技术对其进行遗传改良，培育优质、速生、抗逆新品种成为迫切需求。杂交鹅掌楸‘南林-南森e1号’具有速生、优良材质、抗逆性强、生长快、干型好、材性优等优点，但杂交鹅掌楸良种还未构建高效的体胚发生体系和合适的遗传转化体系。因此，建立杂交鹅掌楸高效遗传转化体系以及缩短其遗传转化的周期具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用精胺处理杂交鹅掌楸‘南林-金森e1号’提高转化效率的方法，用于建立杂交鹅掌楸高效遗传转化体系以及缩短其遗传转化的周期。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种利用精胺处理杂交鹅掌楸‘南林-金森e1号’提高转化效率的方法，包括：

4、1)将良种胚性愈伤组织置于含有目的基因的农杆菌菌液中进行侵染；

5、2)将侵染后的良种胚性愈伤组织接种于共培养培养基中进行共培养；

6、3)将共培养后的良性愈伤组织接种于愈伤延迟筛选培养基中进行筛选培养；

7、4)将筛选培养后的转基因愈伤组织接种于添加精胺的愈伤抗性筛选培养基中进行培养获得遗传转化效率提高的转基因阳性愈伤；

8、5)将转基因阳性愈伤进行植株再生，最终获得遗传转化效率提高的转基因杂交鹅掌楸植株。

9、步骤1)所述侵染时间为10-20min。

10、步骤1)所述侵染时间为10min。

11、步骤2)所述共培养时间为1-3天。

12、步骤2)所述共培养时间为3天。

13、步骤2)所述共培养培养基配方为3/4ms+2,4-d 2mg/l+ba 0.2mg/l+ch 0.5g/l+vc5mg/l+蔗糖30g/l+洋菜2.5g/l+as100mg/l+精胺100mg/l。

14、步骤3)所述筛选培养时间为7-21天。

15、步骤3)所述愈伤延迟筛选培养基的配方为3/4ms+2,4-d 2mg/l+ba 0.2mg/l+ch0.5g/l+vc 5mg/l+蔗糖30g/l+洋菜2.5g/l+cef 400mg/l+精胺0-200mg/l。

16、所述精胺浓度为100mg/l。

17、步骤4)所述添加精胺的愈伤抗性筛选培养基的配方为3/4ms+2,4-d2mg/l+ba0.2mg/l+ch 0.5g/l+vc 5mg/l+蔗糖30g/l+洋菜2.5g/l+cef400mg/l+g418 80mg/l+精胺100mg/l。

18、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

19、1)本申请公开的利用精胺处理杂交鹅掌楸‘南林-金森e1号’提高转化效率的方法，包括：将良种胚性愈伤组织置于农杆菌菌液中进行侵染；将侵染后的良种胚性愈伤组织接种于共培养培养基中进行共培养；将共培养后的良性愈伤组织接种于筛选培养基中进行筛选培养；将筛选培养后的转基因愈伤组织接种于添加精胺的抗性培养基中进行培养获得遗传转化效率提高的转基因阳性愈伤；将转基因阳性愈伤进行植株再生，最终获得遗传转化效率提高的转基因杂交鹅掌楸植株。

20、2)本申请对比新增阳性愈伤占比比率、愈伤dna检测、细胞分析发光率及植株数目统计，得出结论：侵染10min、共培养3d、抗生素延迟筛选14d是最佳的转基因条件。

21、3)本申请筛选出了合适杂交鹅掌楸‘南林-金森e1号’良种遗传转化阳性细胞的筛选条件以及受体细胞类型，还筛选出了适宜进行转化的胚性受体细胞培养时间节点。并且通过在抗性培养基上添加不同浓度的psk和精胺，发现psk并不会分析良种的转化效率，100mg/l精胺处理能够改善良种愈伤状态，提高良种转化效率，缩短转化周期。

技术特征：

1.一种利用精胺处理杂交鹅掌楸‘南林-金森e1号’提高转化效率的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述侵染时间为10-20min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述侵染时间为10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述共培养时间为1-3天。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)所述共培养时间为3天。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述共培养培养基配方为3/4ms+2,4-d 2mg/l+ba 0.2mg/l+ch 0.5g/l+vc 5mg/l+蔗糖30g/l+洋菜2.5g/l+as100mg/l+精胺100mg/l。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述筛选培养时间为7-21天。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述愈伤延迟筛选培养基的配方为3/4ms+2,4-d 2mg/l+ba 0.2mg/l+ch 0.5g/l+vc 5mg/l+蔗糖30g/l+洋菜2.5g/l+cef400mg/l+精胺0-200mg/l。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述精胺浓度为100mg/l。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述添加精胺的愈伤抗性筛选培养基的配方为3/4ms+2,4-d 2mg/l+ba 0.2mg/l+ch 0.5g/l+vc5mg/l+蔗糖30g/l+洋菜2.5g/l+cef 400mg/l+g418 80mg/l+精胺100mg/l。

技术总结本发明公开了一种利用精胺处理杂交鹅掌楸‘南林‑金森E1号’提高转化效率的方法，涉及植物遗传转化技术领域。本申请公开的利用精胺处理杂交鹅掌楸‘南林‑金森E1号’提高转化效率的方法，包括：将良种胚性愈伤组织置于含有目的基因的农杆菌菌液中进行侵染后分别进行共培养、筛选培养后接种于添加精胺的抗性培养基中进行培养获得遗传转化效率提高的转基因阳性愈伤；将转基因阳性愈伤进行植株再生，最终获得遗传转化效率提高的转基因杂交鹅掌楸植株。最终得出结论：侵染10min、共培养3d、抗生素延迟筛选14d是最佳的转基因条件；100mg/L精胺处理能够改善良种愈伤状态，提高良种转化效率，缩短转化周期。技术研发人员：陈金慧,施季森,林梦缘,郝兆东,鲁路,陈海强,刘鹏受保护的技术使用者：南京林业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/26