一种用于内皮细胞靶向敲降BRD4的重组腺病毒

本发明属于生化医药领域，具体涉及一种内皮细胞靶向敲降brd4的重组腺病毒及其在狼疮性肾炎治疗中的应用。

背景技术：

1、内皮细胞是血管内壁的薄层上皮细胞，沿机体整个循环系统分布，由心脏直至最小微血管。内皮细胞涉及丰富的血管生物学功能，包括：血管收缩及舒张从而控制血压、凝血抗凝与纤溶、动脉硬化、血管生成、炎症反应如白细胞进出血管、物质过滤等。在自身免疫性疾病如狼疮中，内皮细胞增生、功能损伤、内皮屏障破坏，表现为严重且广泛的全身血管炎。在肿瘤疾病中，内皮细胞异常增生，促进肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞扩散，摧毁机体的正常稳态。因此，靶向内皮细胞的致病基因，对免疫性疾病和肿瘤，具有治疗意义。

2、brd4又称为溴结构域蛋白4，它是一种转录调节因子。brd4是溴结构域和超末端结构域家族的一员，能够与乙酰化的组蛋白和非组蛋白结合，进而调节基因复制和转录，影响细胞周期、细胞分化、信号转导等过程。作为表观遗传阅读器，brd4在免疫性疾病、肿瘤等疾病状态下的机体表达水平增高。申请人研究表明brd4在狼疮性肾炎患者肾组织的内皮细胞中显著表达增加，并可反映该疾病的严重程度，这为内皮细胞靶向敲低brd4的治疗手段探索提供了理论依据。

3、但经过检索，现有技术中并没有一种成功靶向内皮细胞brd4的干预策略。因此，本领域需构建一种用于内皮细胞靶向敲降brd4的基因操作工具或药物。

技术实现思路

1、正常生理情况下，brd4主要参与细胞周期过程中的基因表达调控，其可以与乙酰化染色质结合，保持各种基因在细胞分裂循环过程中的稳定表达，这种现象被称为表观遗传记忆或基因转录的“书签”。brd4表达失调与白血病、乳腺癌等多种癌症形成有关。brd4最为引人关注的是，研究发现它可能是潜在的癌症治疗靶点。该分子在内皮细胞和免疫细胞表达丰富，且在细胞周期中具有转录和表观遗传调控的重要作用。brd4表达特点及在细胞周期调控和分化中的重要作用使其成为癌症和免疫系统疾病的新兴治疗靶点。

2、brd4是调控内皮细胞损伤的重要参与者。brd4抑制剂如jq1可改善内皮损伤，减少动脉粥样硬化、血管生成、内膜增生、肺动脉高压和心肌肥厚。在心肌纤维化模型中，抑制brd4可减轻主动脉缩窄和tgf-β诱导的内皮-间充质转化和心脏纤维化。在肝损伤模型中，肝窦内皮细胞p300与nfκb和brd4的相互作用增加了ccl2的表达，引起肝脏巨噬细胞聚集、门脉高压和肝纤维化。在急性肾损伤模型中，抑制brd4可减少缺血再灌注肾损伤后中性粒细胞的活化和血管内皮的粘附。同时，brd4抑制剂jq1可通过抑制baff、促炎细胞因子和抗ds-dna抗体的产生，有效缓解mrl-lpr狼疮小鼠的症状。因此，抑制brd4可缓解内皮细胞功能损伤和内皮相关疾病，可能是多种炎症和自身免疫性疾病的有效治疗靶点。

3、靶向致病基因brd4的重组腺病毒，特异性作用于内皮细胞，将在体内高效敲低内皮细胞中异常表达的brd4，进而抑制brd4下游炎症及肿瘤促进基因的表达，是一种新型的靶向治疗策略。发明人在免疫相关性肾炎即狼疮性肾炎小鼠体内注射该重组病毒，取得了较好的治疗效果，提示内皮细胞靶向敲降brd4有望成为临床新型药物干预方式。

4、本发明首先提供一种工具序列，所述工具序列为shrna编码敲降brd4的dna序列，该dna序列为：

5、

6、本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒呈环状，且所述重组质粒包括如上所述的工具序列，且包括egfp序列和具有内皮细胞特异性启动子序列。

7、在一种具体的实施方式中，所述内皮细胞特异性启动子为tie。

8、在一种具体的实施方式中，所述重组质粒包括质粒gv685和插入在质粒gv685的mcs位置的所述工具序列。

9、本发明还提供一种用于内皮细胞靶向敲降brd4的重组腺病毒，它包装有如上所述的重组质粒。

10、本发明中，所述重组腺病毒中包含egfp片段，因而在活体内可以观察到转染阳性的内皮细胞绿色荧光。

11、本发明还提供一种用于治疗狼疮性肾炎、狼疮性血管炎或癌症的基因操作工具，包括如上所述的重组腺病毒以及内皮高转导血清。

12、重组腺病毒是目前广泛使用的基因转导及基因治疗工具，在中枢神经系统、肝脏、心脏、肺脏、血管、皮肤等疾病的基因治疗方面都有应用。本发明中，所述重组腺病毒跟腺病毒一样，它与人和动物的细胞具有高亲和性，且不致病，因而能成为良好的基因操作治疗工具。

13、本发明所述的重组腺病毒，它只在特定的内皮细胞中启动brd4基因的敲降，克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，能增加转基因的效果。

14、本发明所述的重组腺病毒可将特异性启动子靶向转录能力结合内皮高效aav血清，增强靶向感染能力，该基因操作工具使brd4在内皮细胞的敲降更精准、更高效。

15、在使用该基因操作工具时，将该重组腺病毒分散在内皮高转导血清中，并注射进入狼疮小鼠体内，有助于狼疮性肾炎及狼疮血管炎的改善。

16、本发明具有以下有益效果：

17、1.本发明中只作用于内皮细胞，所启动的外源基因brd4的敲降仅在内皮细胞特异表达，从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果；且组织特异性表达可降低免疫反应，因而本发明所述的基因操作工具更加适用于疾病机制及治疗的研究。

18、2.重组腺病毒血清型种类众多，其衣壳蛋白氨基酸序列、结构以及它们与宿主细胞因子相互作用的差异性导致不同血清型aav对不同的组织和细胞感染效率不同，本发明中的基因操作工具中包括内皮高转导血清，将大大提高转导效率。

19、3.本发明所述基因操作工具精准且高效，本发明所述重组腺病毒具有较好的特异性和应用前景。

技术特征：

1.一种工具序列，其特征在于，所述工具序列为shrna编码的敲降brd4的dna序列，该dna序列为：

2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒呈环状，且所述重组质粒包括如权利要求1所述的工具序列，且包括egfp序列和具有内皮细胞特异性启动子序列。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述内皮细胞特异性启动子为tie。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括质粒gv685和插入在质粒gv685的mcs位置的所述工具序列。

5.一种用于内皮细胞靶向敲降brd4的重组腺病毒，其特征在于，它包装有如权利要求2～4中任意一项所述的重组质粒。

6.一种用于治疗狼疮性肾炎、狼疮性血管炎或癌症的基因操作工具，其特征在于，包括权利要求5所述的重组腺病毒以及内皮高转导血清。

技术总结本发明首先提供一种工具序列，所述工具序列为shRNA编码的敲降BRD4的DNA序列。本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒呈环状，且所述重组质粒包括如上所述的工具序列，且包括EGFP序列和具有内皮细胞特异性启动子序列。本发明还提供一种用于内皮细胞靶向敲降BRD4的重组腺病毒，它包装有如上所述的重组质粒。本发明还提供一种用于治疗狼疮性肾炎、狼疮性血管炎或癌症的基因操作工具，包括如上所述的重组腺病毒以及内皮高转导血清。本发明所述的基因操作工具能特异性作用于机体内皮细胞，能够为由于BRD4表达异常增高所引起的疾病提供新的靶向治疗途径，特别是免疫相关性肾脏病如狼疮性肾炎，具有较大的应用前景。技术研发人员：王萱,倪鑫,张卫茹,彭一,何宜菲,丛静,周月圆,林涛受保护的技术使用者：中南大学湘雅医院技术研发日：技术公布日：2024/9/26