一种基于同源重组的克罗诺杆菌基因敲除系统的构建方法与应用

本发明涉及微生物基因工程领域，尤其是涉及一种基于同源重组的克罗诺杆菌基因敲除系统的构建方法与应用。

背景技术：

1、阪崎肠杆菌(enterobacter sakazakii)是一类周生鞭毛、无芽孢、兼性厌氧的革兰氏阴性致病菌，在一定条件下可引起人和动物致病。2008年iverson依据生理生化特性将该菌划分为一个新的属——克罗诺杆菌属(cronobacter spp.)。目前国际上公认的克罗诺杆菌属细菌共有7个种，包括c.sakazakii、c.malonaticus、c.dublinensis、c.muytjensii、c.turicensis、c.condimenti和c.universalis等，其中c.sakazakii、c.malonaticus和c.turicensis与新生儿致病密切相关。

2、克罗诺杆菌，能引起各年龄段人群的感染，特别是新生儿、婴幼儿及免疫力低下的人群。其轻微症状包括发热、困乏或食欲不振，而严重者则可能出现小肠结膜炎、败血症和脑膜炎等，致死率可达80％，部分患者接受治疗后，也会终身伴随神经性后遗症。

3、基因敲除是研究细菌基因功能最经典和最有效的方法，也是细菌致病机理研究中必不可少的手段之一。由于克罗诺杆菌对许多抗生素有抗性，且敏感的抗生素种类也不相同，导致克罗诺杆菌的基因敲除系统不易构建，而且不同克罗诺杆菌甚至同一个种的不同菌株其有效的基因敲除系统也不相同，不能共用。因此，针对克罗诺杆菌基因敲除系统的构建，有助于对进行分子操作，特别是可为其毒力因子的合成、遗传调控和致病机理研究奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了解决现有技术中克罗诺杆菌的基因敲除系统敲除效率低的问题而提供一种可以提高克罗诺杆菌基因敲除效率的方法。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、一种基于同源重组的克罗诺杆菌基因敲除系统的构建方法，具体步骤如下：

4、s1、将目的基因的上游同源臂和下游同源臂插入敲除质粒，构建含有目的基因同源臂的重组基因敲除载体，

5、所述目的基因包括cpxr基因、adra基因和bcsa基因，

6、当目的基因为cpxr基因时，所述上游同源臂引物为cpxr-af/cpxr-ar，所述cpxr-af的序列如seq id no.10所示，所述cpxr-ar的序列如seq id no.11所示，所述下游同源臂引物为cpxr-bf/cpxr-br，所述cpxr-bf的序列如seq id no.12所示，所述cpxr-br的序列如seq id no.13所示，

7、当目的基因为adra基因时，所述上游同源臂引物为adra-af/adra-ar，所述adra-af的序列如seq id no.16所示，所述adra-ar的序列如seq id no.17所示，所述下游同源臂引物为adra-bf/adra-br，所述adra-bf的序列如seq id no.18所示，所述adra-br的序列如seq id no.19所示，

8、当目的基因为bcsa基因时，所述上游同源臂引物为bcsa-af/bcsa-ar，所述bcsa-af的序列如seq id no.22所示，所述bcsa-ar的序列如seq id no.23所示，所述下游同源臂引物为bcsa-bf/bcsa-br，所述bcsa-bf的序列如seq id no.24所示，所述bcsa-br的序列如seq id no.25所示；

9、s2、将步骤s1中得到的重组基因敲除载体通过接合的方式转入克罗诺杆菌中，得到交换子；

10、s3、将步骤s2中得到的交换子依次经过琼脂平板法和pcr验证，得到基因敲除突变体。

11、进一步地，步骤s1中，构建重组基因敲除载体的方法如下：

12、s1-1、设计目的基因上游同源臂引物和下游同源臂引物，利用pcr扩增目的基因的上下游同源臂；

13、s1-2、将步骤s1-1中得到的上下游同源臂连接至质粒上，得到用于基因敲除的重组载体；

14、s1-3、将步骤s1-2中得到的重组载体以热激转化的方式转入感受态细胞中，涂布于含氯霉素的琼脂平板上静置培养，得到含有重组载体的大肠杆菌，即重组基因敲除载体。

15、上述更进一步地，步骤s1-3中，所述感受态细胞为s17-1λpir感受态细胞。

16、上述更进一步地，步骤s1-3中，所述含氯霉素的琼脂平板为含20～30μg/ml氯霉素的lb平板。

17、进一步地，步骤s1中，所述质粒为自杀质粒pre112。

18、进一步地，步骤s2中，所述克罗诺杆菌为阪崎克罗诺杆菌cr14。

19、进一步地，步骤s2中，所述接合条件为：采用含有添加剂的lb培养基静置培养，先在37℃培养箱中正置培养1h后，然后在37℃培养箱中倒置培养24h。

20、上述更进一步地，所述添加剂选自氨基寡糖或抗菌肽中的任意一种或多种。

21、进一步地，步骤s3中，当目的基因为cpxr基因时，所述pcr突变体验证引物为cpxr-pf/cpxr-pr，所述cpxr-pf的序列如seq id no.14所示，所述cpxr-pr的序列如seq idno.15所示。

22、进一步地，步骤s3中，当目的基因为adra基因时，所述pcr突变体验证引物为adra-pf/adra-pr，所述adra-pf的序列如seq id no.20所示，所述adra-pr的序列如seq idno.21所示。

23、进一步地，步骤s3中，当目的基因为bcsa基因时，所述pcr突变体验证引物为bcsa-pf/bcsa-pr，所述bcsa-pf的序列如seq id no.26所示，所述bcsa-pr的序列如seq idno.27所示。

24、进一步地，步骤s3中，所述交换子的验证方法如下：

25、s3-1、将交换子涂布于含有显色底物和氯霉素的琼脂平板上静置培养，挑取蓝绿色的单菌落进行pcr验证，筛选一次交换子；

26、s3-2、通过载体所带的致死基因进行二次交换子的筛选：挑取一次交换子单菌落于液体培养基中进行二次交换培养，涂布于固体培养基平板上静置培养，挑取单菌落进行pcr验证，筛选二次交换子，二次交换子即基因敲除突变体。

27、上述更进一步地，步骤s3-1中，所述琼脂平板中显色底物浓度为90～110μg/ml，所述氯霉素浓度为20～30μg/ml。

28、上述更进一步地，步骤s3-1中，所述琼脂平板为lb平板，所述显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-α-d葡萄糖苷或者其他类型的显色底物。

29、上述更进一步地，步骤s3-2中，所述致死基因为sacb蔗糖致死基因。

30、上述更进一步地，步骤s3-2中，所述液体培养基为无抗性的lbns液体培养基。

31、上述更进一步地，步骤s3-2中，所述二次交换培养的条件为：200r/min培养6-24h；

32、所述二次交换培养温度选自37℃、40℃或4℃中的任意一种温度或多种温度组合。

33、上述更进一步地，步骤s3-2中，所述固体培养基为质量分数15％蔗糖的lbns琼脂平板。

34、此外，本发明还提供一种基于同源重组的克罗诺杆菌基因敲除系统的应用，上述的构建方法构建得到的克罗诺杆菌基因敲除系统在毒力因子合成、遗传调控以及致病机理研究中的应用。

35、此外，本发明还提供一种重组菌株，所述重组菌株为将克罗诺杆菌采用上述的构建方法处理后得到的目标菌株。

36、进一步地，所述重组菌株为敲除cpxr基因、adra基因或bcsa基因的阪崎克罗诺杆菌cr14。

37、与现有技术相比，本发明的有益效果如下所示：

38、本发明针对克罗诺杆菌基因敲除系统敲除效率低下的问题，提出一种提高克罗诺杆菌基因敲除效率的方法，极大地提高了基因敲除效率。

39、本发明利用能够提高细胞通透性的特定分子量氨基寡糖、或者抗菌肽或者两者组合提高敲除载体的转入效率；通过在培养基添加显色底物，利用克罗诺杆菌α-葡萄糖苷酶活性，快速筛选出基因敲除菌株；并且利用特定的培养方式提高基因敲除效率。

40、本发明提供的基因敲除突变体可应用于毒力因子合成、遗传调控以及致病机理的研究中。