丛毛红曲菌突变菌株在发酵生产功能活性物质中的应用

本发明涉及食品营养，具体地指一种丛毛红曲菌突变菌株在发酵生产功能活性物质中的应用。

背景技术：

1、随着现代社会人类生活方式的变化，心脑血管疾病的发病率和死亡率不断上升，而高脂血症是心脑血管疾病的危险因素。现阶段，他汀类药物是治疗高脂血症相关疾病重要的降胆固醇药物，占有很大的市场份额。现代医学研究表明，红曲菌发酵产生的莫纳可林k(monacolin k，mk)与洛伐他汀具有相似的化学结构，可以直接发挥降血脂作用而无需肝脏水解，在发挥药用活性的同时减少了副作用，具有更高的安全性。而随着功能微生物发酵在强化风味和活性组分合成中逐渐表现出的优势，消费者对传统药食同源制品需求逐步增加，红曲制品受到越来越多的重视。

2、通过天然红曲菌进行发酵获得的红曲制品中，其活性成分尤其是莫纳可林k的产量较低，而随着红曲制品受到的关注越来愈多，提高红曲制品中活性成分尤其是莫纳可林k的产量，缩短发酵周期是红曲制品生产研究的重要方向。

3、通过传统的遗传育种技术可以获得高产及抗逆性强的优良菌株，因此，利用基因编辑进行菌株改良，获得遗传稳定的优良菌株是现代基因工程育种的目的，而高效的基因编辑技术以及多基因编辑工具的开发无疑能够有效提高基因工程育种的效率。近年来，由dna识别结构域和核酸酶结构域组成的序列特异性核酸酶(ssns)—crispr/cas9系统被开发应用于丝状真菌基因编辑，使用组成型强启动子gpda(pgpda)和终止子trpc(ttrpc)确保含有单向引导rna(single guide rna，sgrna)的转录本在体内的释放，构巢曲霉ama1序列作为骨架构建的质粒可以在生物体内独立复制，而真菌筛选标记的引入便于后续突变菌株的筛选。到目前为止，这样通用的crispr/cas9基因编辑系统已经成功应用于多种丝状真菌的基因编辑，在黑曲霉中，由于筛选标记的可回收性，通过迭代回收成功实现了crispr/cas9系统介导的多基因编辑。而且，通过质粒的迭代回收，可以获得无外源遗传物质引入的突变菌株，具有更好的安全性和商业应用价值。

4、通过基因组学和分子生物学联合分析发现，红曲菌中mk的合成由9个已知功能的基因聚集在一起的生物合成基因簇催化，这些基因的转录受到多水平的调控，其中，组蛋白是构成染色质的核心蛋白，通过化学修饰改变dna和组蛋白之间的相互作用可以影响基因的表达。在紫色红曲菌中，h3k4甲基转移酶的失活导致了明显的生长抑制，使得桔霉素和色素的合成受阻，这表明组蛋白甲基化修饰确实会影响红曲菌次级代谢产物生物合成。

5、然而，红曲制品不只含有莫纳可林k，还含有其它功能活性物质，如何在提高莫纳可林k产量的同时不影响其它功能活性物质的产量，甚至还能提高其它功能活性物质的产量，目前相关研究很少。

技术实现思路

1、为克服上述技术的不足，本发明的目的在于提供一种丛毛红曲菌突变菌株在发酵生产功能活性物质中的应用，使用该丛毛红曲菌突变菌株进行发酵时，可同时高产莫纳可林k、黄酮和酚类。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种丛毛红曲菌突变菌株在发酵生产功能活性物质中的应用，所述功能活性物质包括莫纳可林k、黄酮和酚类中的一种或多种。

4、一种丛毛红曲菌突变菌株在发酵过程中提高莫纳可林k产量中的应用。

5、上述应用中，所述丛毛红曲菌突变菌株以丛毛红曲菌ms-1作为出发菌种，在丛毛红曲菌ms-1的基因组上敲除组蛋白h3k9甲基转移酶基因mpclr4中编码set结构域的序列；所述mpclr4的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述mpclr4中编码set结构域的序列如seqid no：2所示。

6、优选地，所述发酵过程中，培养基为谷物与米粉复配而成的固态发酵培养基。

7、优选地，所述固态发酵培养基中，谷物与米粉的质量比为1﹕1～3；所述谷物为黑米、胚芽和燕麦中的任意一种或多种。

8、优选地，所述固态发酵培养基中，谷物与米粉的质量比为1﹕1；所述谷物为燕麦和黑米中任意一种。

9、优选地，所述丛毛红曲菌突变菌株的构建方法为：制备丛毛红曲菌ms-1的原生质体，并结合crispr/cas9系统和原生质体转化法将丛毛红曲菌ms-1基因组中组蛋白h3k9甲基转移酶基因mpclr4中编码set结构域的序列进行基因敲除。

10、优选地，所述原生质体的制备方法如下：将丛毛红曲菌ms-1菌丝体通过混合酶进行酶水解，随后收集和纯化获得原生质体。

11、优选地，所述混合酶溶解在渗透压稳定剂中；所述混合酶中各成分及其在渗透压稳定剂中的质量体积百分比如下：溶壁酶0.4％、裂解酶0.4％、纤维素酶1.6％、蜗牛酶1.2％。

12、优选地，所述渗透压稳定剂的ph为5.8；所述渗透压稳定剂包括：0.9m nacl、5mmdtt、10mmna2hpo4/nah2po4。

13、上述丛毛红曲菌ms-1于公告号为cn103468585b、发明名称为“一株红曲菌株及其在制备功能性红曲中的应用”的中国发明中公开，丛毛红曲菌ms-1已于2013年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称为cctcc，地址为：湖北省武汉市洪山区八一路)，保藏编号为：cctcc m2013295，分类命名为丛毛红曲菌(monascuspilosus)。

14、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

15、本发明首先开发了一种适用于红曲菌制备高质量原生质体的方案，利用高速培养收集幼嫩的菌丝，利用混合酶进行温和水解以获得高活性的原生质体。其次，利用crispr/cas9系统进行基因编辑需要设计靶向目标序列区域的sgrna，本发明利用多平台设计sgrna序列，并通过gibsonassembly高效构建含有sgrna和cas9蛋白的表达载体用于转化，成功获得突变菌株后利用传代培养去除转化质粒获得改良菌株。最后，本发明将获得的基因敲除菌株δmpclr4应用于发酵，检测以不同谷物为培养基质进行发酵产生的天然活性物质的含量。

16、本发明将依赖于原生质体转化的crispr/cas9系统应用于丛毛红曲菌ms-1的基因编辑中，产生基因改良菌株，由于其筛选标记不整合到受体基因组，因此，可获得适用于商业应用的高产mk的丛毛红曲菌突变菌株δmpclr4。本发明获得的高产mk的丛毛红曲菌突变菌株δmpclr4在不同谷物与米粉复配而成的固态发酵培养基进行发酵时可联产莫纳可林k、黄酮和酚类，在提高莫纳可林k的同时也提高了黄酮和酚类的产量，而在实际应用中这些天然活性物质赋予发酵产物更高的应用价值。

17、(1)本发明方法可高效制备丝状真菌的原生质体，利用混合酶温和水解菌丝体，2h即可获得结构完整且具有较高活性的原生质体，适用于制备米曲霉、丛毛红曲菌和红色红曲菌的原生质体。

18、(2)本发明通过依赖于原生质体的转化将crispr/cas9系统应用于丛毛红曲菌进行基因编辑。

19、(3)本发明利用crispr/cas9系统进行基因敲除后，由于筛选标记不整合到受体基因组，因此，通过在无筛选药物的pda培养基上传代培养获得了无筛选标记的基因敲除菌株δmpclr4，将获得的基因敲除菌株δmpclr4应用于产mk液态发酵，无筛选标记的菌株也显示出良好的发酵能力。且本发明获得的高产mk的基因敲除菌株δmpclr4可联产莫纳可林k、黄酮和酚类，在提高莫纳可林k的同时提高了黄酮和酚类的产量。