一种嘉兰染色体核型的分析方法

本发明涉及染色体核型分析，更具体的说是涉及一种嘉兰染色体核型的分析方法。

背景技术：

1、嘉兰(gloriosa superba l.)，又名嘉兰百合(glory lily)，为秋水仙科(colchicaceae)嘉兰属的多年生攀援草本植物，原产于非洲热带地区，在亚洲的部分热带地区亦有分布，如印度、缅甸、马来西亚和孟加拉国等。在中国，嘉兰分布于云南南部(西双版纳)，是该属植物在国内唯一分布的一个种。嘉兰是印度泰米尔纳德邦的州花，也是津巴布韦的国花。因其红黄色相间的皱波状花被片似燃烧的火焰，花色艳丽，观赏价值高，在园艺上备受全球植物爱好者的喜欢。

2、嘉兰块状、肉质的根状茎富含秋水仙碱，具有剧毒。秋水仙碱是一种生物碱，主要用于治疗关节炎、风湿痛、类风湿关节炎等疾病，因其能够抑制癌细胞的分裂，在临床上也被用于癌症治疗。因此，嘉兰也是一种重要的药用植物，具有镇痛、抗炎、抗菌、抗癌、致突变、驱虫、抗氧化、抗血栓等药理活性作用，在全球许多国家的本土医药系统中被广泛用于肠道寄生虫、痛风、关节炎、蛇咬伤和皮肤等人类疾病的治疗。

3、近年来，为满足国内和国际药物市场的的需求，嘉兰被过度采挖和开发，现已被列入世界自然保护联盟(international union for conservation ofnature)红色名录。因此，嘉兰的野生资源急需保护。但在保护之前，物种的准确鉴定和遗传信息获取非常重要。

4、核型分析(karyotype analysis)是一种获取物种细胞学信息的稳定可靠方法。目前，一些学者开展了嘉兰的染色体核型研究，但多集中在基于染色体形态和数目的传统核型分析，并不能提供基因组组成的细节信息。

5、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization)(fish)是一种更为有力的核型分析方法。该方法通过探针杂交能够准确定位重复序列在染色体上的位置，从而揭示基因组组成和染色体核型变异。核糖体dna(rdna)和端粒重复序列是两种常见的串列重复序列，在许多植物染色体核型图谱分析和构建中作为首选的染色体标记探针，如一粒小麦(triticum monococcum)、水曲柳(fraxinus mandshurica)和四棱梣(f.quadrangulate)、海滨木槿(hibiscus hamabo)、沙棘(hippophae rhamnoides)、向日葵属(helianthus)和龙血树属(dracaena)。

6、因此，如何以核糖体dna(rdna)和端粒重复作为探针的荧光原位杂交用于嘉兰染色体的核型细节分析是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种嘉兰染色体核型的分析方法，以解决现有技术中的不足。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种嘉兰染色体核型的分析方法，具体包括以下步骤：

4、(1)根尖处理

5、待嘉兰幼苗根长至1～2cm时，将生长旺盛的根尖剪下，放入离心管，n2o处理，冰醋酸固定，保存；

6、(2)染色体制片

7、将处理后的根尖进行清洗，吸掉水分，置于载玻片上切下根尖分生区，酶解，清洗，脱水，加入乙酸，捣碎制成悬浮液，滴于新的载玻片上，风干，镜检，标记，保存；

8、(3)荧光原位杂交

9、①染色体检查：将载玻片烘干，检查中期染色体分裂相是否完整；

10、②染色体变性：将含有较好分裂相的载玻片放入氢氧化钠混合液中，水浴变性；

11、③梯度脱水：将载玻片在浓度梯度的乙醇中处理，风干，备用；

12、④探针变性：将fish杂交液体系进行变性，然后转移至无水乙醇中处理，得到变性探针混合液；

13、其中，fish杂交液体系包括探针和杂交缓冲液；探针包括tamra标记的5s rdna、fam标记的45s rdna、fam标记的(ag3t3)3和tamra标记的端粒重复序列(tttaggg)3；

14、⑤探针杂交：将变性探针混合液滴于载玻片上标记的染色体区域，盖上盖玻片，孵化；

15、⑥洗脱：清洗，洗去盖玻片，再次清洗，风干，染色，盖上盖玻片；

16、⑦信号检测与图像获取：检测杂交信号，采集图像；

17、⑧回收：揭掉盖玻片，沸水浴处理，然后在浓度梯度的乙醇中处理，风干，曝光，保存；

18、⑨图像处理；

19、(4)核型分析

20、至少30个染色体分散均匀、形态清晰且数目完整的体细胞中期染色体分裂相被用于染色体数目确定，至少有3个质量较好的分裂相被用于核型和杂交信号模式的分析，最后，结合形态，着丝粒位置、杂交信号特征，所有染色体按长度排列，从最长的染色体到最短的染色体。

21、进一步，上述步骤(1)中，n2o处理的压强为1.0mpa，时间为2h；冰醋酸固定的时间为10min；保存的溶液为75％乙醇，温度为-20℃。

22、进一步，上述步骤(2)中，清洗的溶液为ddh2o，次数为3次；酶解的溶液为酶解液，温度为37℃，时间为50min；酶解液的制备方法为：称取0.04g纤维素酶和0.02g果胶酶溶于1ml酶缓冲液中；酶缓冲液的制备方法为：称取0.5707g柠檬酸三钠和0.4324g柠檬酸，加入ddh2o溶解并定容至50ml；镜检的设备为dm750显微镜；标记具体为：将染色体分散均匀、形态清晰且数目完整的分裂相用铅笔在载玻片上标记；保存的温度为-20℃。

23、进一步，上述步骤(3)①中，烘干的温度为37℃；检查的设备为dm750显微镜；。

24、进一步，上述步骤(3)②中，氢氧化钠混合液的制备方法为：称取3g氢氧化钠溶于500ml 70％乙醇中；水浴变性的温度为42℃，时间为6min。

25、进一步，上述步骤(3)③中，乙醇的浓度梯度分别为75％、95％、100％，各处理5min。

26、进一步，上述步骤(3)④中，fish杂交液体系的制备方法为：每种探针0.5μl，再加入杂交缓冲液至10μl，充分混匀；杂交缓冲液的制备方法为：将2×ssc缓冲液和1×te缓冲液等体积混合；2×ssc缓冲液的制备方法为：称取8.823g柠檬酸三钠和17.532g氯化钠溶于ddh2o中，定容至1000ml；变性的条件为避光，设备为变性炉，温度为85℃，时间为5min；无水乙醇的温度为-20℃；处理的时间为至少10min。

27、进一步，上述步骤(3)⑤中，孵化的设备为孵化盒，温度为37℃，时间为2h。

28、进一步，上述步骤(3)⑥中，清洗的条件为避光，溶液为2×ssc缓冲液，次数为2次，每次5min；再次清洗的溶液为ddh2o，次数为2次，每次5min；染色的试剂为dapi工作溶液，用量为10μl；dapi工作溶液的制备方法为：将dapi原液与1×pbs缓冲液以1:2的体积比稀释；1×pbs缓冲液的制备方法为：称取6g氯化钠、0.2g氯化钾、1.42g磷酸氢二钠和0.27g磷酸二氢钾溶于ddh2o中，定容至1000ml。

29、进一步，上述步骤(3)⑦中，检测的设备为奥林巴斯bx-53正置荧光显微镜；采集图像的设备为photometric sensys olympus dp73ccd camera；

30、进一步，上述步骤(3)⑧中，沸水浴处理的溶液为2×ssc缓冲液，时间为5min；乙醇的浓度梯度分别为70％、95％、100％，各处理5min；曝光的时间为1～2天，保存的温度为-20℃；

31、进一步，上述步骤(3)⑨中，图像处理采用adobe photoshopv7.0软件。

32、进一步，上述步骤(4)中，使用karyotypeanalysis 2.0完成染色体长度的测量，使用photoshop v7.0完成染色体的抠图和图层排版。

33、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

34、本发明首次利用4种寡核苷酸探针(5s rdna、45s rdna、(ag3t3)3和拟南芥类型端粒重复序列)来构建嘉兰fish核型，对嘉兰染色体的核型细节进行了分析，最终确定了嘉兰染色体组中rdna和端粒重复的数量和位置，揭示了每条染色体末端的结构完整性等。