一种纳米诊疗制剂及其制备方法和应用

本发明属于生物医学诊疗，特别是涉及一种纳米诊疗制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肺纤维化(pf)是一种慢性、进行性的恶性肺间质疾病。肺纤维化患者预后很差，确诊后的中位生存期仅3-5年，五年的死亡率超过50％，其恶性程度已经超过多种恶性肿瘤(如胃癌、睾丸癌等)。由于该疾病的发病机制尚不清楚，临床上缺乏有效的治疗方法。当前，除肺移植外，尚无有效的手段能够逆转肺部纤维化和修复损伤肺功能。

2、多项临床研究表明间充质干细胞(mscs)移植能够有效缓解肺纤维化疾病进程，已成为个体化治疗肺纤维化的理想选择。但是该治疗方案在临床转化过程中仍然面临巨大挑战：(1)纤维化肺部的炎症反应和氧化应激环境导致移植后mscs失活和功能受损，从而严重降低了其治疗效果；(2)当前mscs移植后只能通过疾病症状改善或者缓解来评估治疗效果，无法实时获取mscs在体内的迁移、归巢、分布和存活等生物学信息，从而难以对治疗过程进行及时、精准评估以施予相应的医疗干预。因此，研发移植mscs抗氧化保护联合体内示踪的多功能诊疗制剂对实现干细胞治疗基础研究的突破和进一步临床转化具有重要的科学意义和临床治疗价值。

3、通过递送抗氧化物质来清除mscs内活性氧(ros)和改善移植部位的恶劣微环境，是保护移植mscs免受氧化损伤和提高其存活率的有效方式。然而，目前常用的抗氧化剂(维生素、黄酮类、氮氧化物自由基聚化合物等)存在ros清除能力有限和易产生剂量依赖性毒副作用等问题。近期研究表明，具有较强的催化能力及ros清除性能的纳米酶可以模拟细胞内天然酶的功能。该类纳米酶通常有良好的生物相容性，且能够催化ros转化，从而减轻细胞在病理环境中的氧化应激损伤。其中，由氧化铜和氧化亚铜构成的铜氧化物纳米粒子(cuxo nps)具有高效和多样的类抗氧化物酶活性质，能够参与整个ros清除链。因此，将生物相容性好和具有广谱ros清除能力的铜氧化物纳米粒子标记至mscs，能够增强其抗炎、抗氧化应激和抗凋亡的能力，提高移植mscs的体内存活率，改善对肺纤维化的治疗效果。

4、组织活检是目前体内干细胞命运检测和功能评估的主要手段，但这是一种离体分析技术、不能对同一样本进行连续、实时观察，使得在临床前和临床研究中应用受限。计算机断层扫描成像(ct)技术具有临床普及率和空间分辨率高、扫描时间短、组织穿透性强等优势，是肺部移植干细胞活体示踪适用性较好的成像技术。但是，干细胞本身对x射线呈现出较弱的衰减系数，因此须结合示踪剂才能进行有效的ct成像示踪。金纳米粒子(au nps)具有较强的x射线衰减能力、高对比度以及较长的血液保留时间，同时兼具良好的生物安全性，表面易于修饰等特点，是干细胞标记和ct成像较为理想的示踪材料。

5、间充质干细胞移植是一种极具潜力的肺纤维化治疗手段。但是该治疗方案在临床转化过程中面临两大挑战：损伤肺部过度的氧化应激反应和炎症环境影响了干细胞移植后的存活率，使其难以发挥有效的治疗作用；干细胞在治疗过程中的分布、迁移和归巢等情况尚不清楚，影响对治疗过程的优化。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种纳米诊疗制剂，该纳米制剂是以ros敏感性聚合物为基础骨架，同时负载具有ros清除特性的纳米酶和能进行干细胞ct成像的示踪剂。

2、本发明的目的在于提供一种纳米诊疗制剂的应用，该纳米诊疗制剂标记的mscs移植到肺纤维化病灶后，当移植mscs正常存活时，该诊疗制剂能够对其进行ct成像示踪，监测mscs在体内的分布和迁移等生物学信息；当mscs遭受病理微环境的氧化应激损伤，纳米诊疗制剂的外层骨架会自发降解，释放出纳米酶清除ros，实现对移植mscs的抗氧化保护，解决了现有的背景技术提出的问题。

3、本发明的目的还在于提供一种纳米诊疗制剂的制备方法，该制备方法简便，制备条件温和，具有良好的临床转化前景。

4、为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

5、本发明为一种纳米诊疗制剂，包括作为骨架的ros响应性聚合物，且所述骨架内负载有具有ros清除特性的纳米酶和ct成像示踪剂；且所述具有ros清除特性的纳米酶和ct成像示踪剂包载于骨架中，形成壳-核型纳米复合物。

6、进一步地，所述ros响应性骨架为苯硼酸酯修饰葡聚糖聚合物，具有ros清除特性的纳米酶为铜氧化物纳米粒子、二氧化锰纳米粒子、或氧化铈纳米粒子，ct成像示踪剂为金基纳米粒子、铋基纳米粒子、碘基化合物；所述碘基化合物包括碘海醇、碘克沙醇。

7、进一步地，所述纳米诊疗制剂的尺寸大小为145nm-185nm，所述铜氧化物纳米粒子尺寸大小为1.75nm-5.75nm，所述金纳米粒子尺寸大小为2.5nm-5.0nm。

8、一种纳米诊疗制剂的制备方法，采用单乳液法将具有ros清除特性的纳米酶和ct成像示踪剂同时包载于骨架中。

9、进一步地，制备方法包括：

10、步骤1、以葡聚糖和n，n'-羰基二咪唑(cdi)活化的苯硼酸酯(cdi-pbap)为原料，合成ros响应性聚合物苯硼酸酯修饰的葡聚糖(oxi-dex)；

11、步骤2、以氯化铜(cucl2)为前驱体，l-抗坏血酸为还原剂，采用湿化学还原法制备具有ros清除特性的氧化铜纳米粒子(cuxo nps)；

12、步骤3、以四氯金酸为前驱体、硼氢化钠为还原剂，采用双相还原法制备十二烷基硫醇修饰的疏水性aunps；

13、步骤4、用单乳液法将步骤(2)制备得到的cuxo nps和步骤(3)制备得到的aunps包封至步骤(1)制备得到的oxi-dex骨架，获得ros响应性纳米复合物(rsnps)。

14、其中，在所述步骤1中，将葡聚糖、cdi-pbap和4-二甲氨基吡啶溶解于二甲亚砜，将混合液置于37℃水浴中搅拌24h。反应完成后，将混合液在去离子水中沉淀，离心(10000rpm，15min)收集沉淀，经冷冻干燥得到oxi-dex。

15、其中，在所述步骤2中，将cucl2水溶液在80℃油浴中搅拌10min，随后缓慢滴加l-抗坏血酸水溶液，持续搅拌24h。待反应完成后，采用超滤管离心(7000rpm，10min)浓缩粒子并洗涤三次，制备得到cuxo nps。

16、其中，在所述步骤3中，用甲苯溶解四正辛基溴化铵后，滴加该溶液至haucl4水溶液中持续搅拌，直至体系澄清。继而通过分液漏斗分离出有机相，并与十二烷基硫醇混合搅拌均匀。随后，逐滴添加硼氢化钠溶液至上述混合液中于室温下持续搅拌12h。将合成的体系再次分离出有机相并加入乙醇沉淀两次，3500rpm离心10min，水洗3次。所收集的黑色颗粒物被真空干燥后得到金纳米粒子。

17、其中，在所述步骤4中，将步骤1中制备得到的oxi-dex溶解于中chcl3，随后加入等量步骤3中制备得到的aunps形成溶液a。同时，将半量步骤2中制备得到的cuxo nps(20mg)分散至1％pva溶液形成溶液b。混合溶液a和b后置于冰上超声乳化5min。之后，将乳液二次倒入0.3％pva溶液中搅拌过夜以蒸发有机溶剂，5500rpm离心15min收集纳米粒子(rsnps)，并用去离子水洗涤去除未包封的组分；且步骤4中用chcl3溶解oxi-dex的过程需加入ch3oh增溶。

18、一种纳米诊疗制剂在肺纤维化疾病干细胞移植治疗中的应用；所述肺纤维化疾病包括但不限于特发性肺纤维化、结缔组织病相关间质性肺炎、特发性非特异性间质性肺炎、呼吸性细支气管-间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、急性间质性肺炎、慢性过敏性肺炎。

19、本发明具有以下有益效果：

20、本发明构建的纳米诊疗制剂，通过ct成像获取移植mscs体内分布、迁移和归巢等生物学信息，为干细胞治疗肺纤维化提供了一种有效的监测工具。同时，利用氧化应激环境激活的ros清除功能，实现了移植干细胞的保护并增强其对肺纤维化的治疗效果。

21、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。