适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗、制备方法及其应用与流程

本发明涉及疫苗，具体涉及适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗、制备方法及其应用。

背景技术：

1、促卵泡激素(fsh)是一种由垂体分泌的糖蛋白激素，包含两个不同的亚基：α亚基和β亚基。人fshβ亚基由111个氨基酸组成，具有特异性的生物学作用，负责与位于靶细胞表面的fsh受体(fshr)相互作用，通常是睾丸和卵巢(颗粒细胞和塞托利细胞)[1]。因此，fsh在生殖过程中发挥关键作用，刺激女性次级卵泡的窦形成以及窦卵泡的生长和成熟，而男性的fsh负责睾丸的发育和维持。在成熟的生殖腺中，fsh作用于塞托利细胞、精原细胞、初级和次级精母细胞，并驱动精子发生[2]。

2、fsh受体(fshr)的表达不仅限于性腺，最近的研究发现fshr也在性腺外的脂肪组织和肝脏中表达，这表明fsh可能在调节脂质代谢和脂肪堆积中发挥作用[3]。进一步的研究表明，fsh在促进女性和男性脂肪堆积方面起着重要作用。特别是，更年期女性由于卵巢衰竭导致的fsh升高被证实是更年期肥胖和肝脂肪变性的主要原因。使用小鼠模型的研究也表明，高表达fsh是哺乳动物性腺切除术引起的肥胖的主要原因。

3、除了与肥胖紧密相关以外，也有研究发现，fsh能增加骨质疏松症、动脉粥样硬化、高胆固醇血症、前列腺癌和神经退行性疾病风险[4,5].。

4、这些发现为研究人类和哺乳动物的疾病控制提供了新的视角，开发有效的fsh疫苗在控制肥胖症、骨质疏松症和神经退行性疾病方面具有广阔的前景，特别是对于更年期妇女和一些需阉割后再育肥的家畜或宠物。

5、有研究报道基于fshβ亚基的fsh受体结合表位研制了一种新型fsh疫苗。接种这种疫苗对预防小鼠卵巢切除术引起的脂肪堆积非常有效，也能有效地防止以正常食物喂养的完整小鼠的脂肪堆积[6]。这项研究是通过合成串联的fshβ13aa(lvykdparpniqk)并将其与卵清蛋白(fshβ13aa-t-ova)结合，设计了一种新的fsh抗原和疫苗，并使用小鼠模型证明了其在抑制脂肪堆积方面的高效性。这在专利中(cn110694056a)也证实了这种治疗效果。

6、此外，早期的研究显示，fsh已被研究作为开发避孕疫苗的候选药物。接种绵羊fsh(ofsh)后，成年恒河猴的精子发生受到抑制，睾丸萎缩。其他研究小组也独立证实，ofsh免疫会降低bonnet猴和男性的生育力[7-10]。

7、最新研究发现重组fshr亚单位疫苗，能显著抑制青春期前和青春期大鼠睾丸发育和精子发生[11]。

8、这意味着fsh疫苗可能与fshr疫苗作用机制一样，是一种有前途的动物免疫去势方法。面对众多流浪猫、流浪犬以及需要绝育控制繁殖群体的野生动物，都通过手术绝育显然是不现实的。市场仍缺乏更多成熟的免疫去势产品，而fsh疫苗开发将有利于动物和宠物绝育，避免手术去势痛苦、增强动物福利，因此具备巨大的商业价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗、制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗，针对多物种fshβ亚基的特异片段设计，涉及猪、牛、羊、羊驼、马的yetvkvpgcahhadsl片段，犬、貂的yetvrvpgcarhadsl片段，猪、牛、羊、羊驼、猫、兔、鼠的ypvatechcgk片段，人、猪、牛、羊、羊驼、犬、大熊猫、兔、鼠的cdsdstdctvrglgp，猫、虎、狮子的cdsdstdctvqglgp片段其中一个或多种组合，及其任意一段同源性>70％以上的序列。

3、作为优选，上述片段通过刚性接头a(eaaak)n序列连接起来。

4、作为优选，为增强免疫原性，在刚性接头序列两侧添加tev酶切序列enlyfqsa，使其与刚性接头a(eaaak)n融合后具备能使整个抗原形成稳定的二聚体的卷曲螺旋coiledcoil结构，增加促溶肽以增强细胞表达，并在抗原c末端融合抗菌肽进一步增强免疫原性。

5、适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗制备方法及其应用，以乳膏、油、软膏、粉末或凝胶形式进行局部使用。

6、适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗制备方法及其应用，以口服、透皮、透粘膜、肌肉内、静脉内或皮下方式进行给药。

7、一种适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗的制备方法，步骤如下：

8、1)将序列合成并构建到载体pcdna3.4；

9、2)转染前细胞传代：培养细胞时培养液体积不得超过摇瓶体积的1/5，每隔3-4天传代1次，传代时先做细胞准确计数，确认密度后无需离心，将细胞悬液依照所需比例配制到hi-kdcho培养液中，使传代后的细胞密度控制在0.4-0.6×106cells/ml之间；

10、3)准备转染细胞：将chok1-hi细胞置于5％的co2恒温摇床中，37℃恒温震荡培养，确定其细胞密度及存活率，待细胞生长至密度为6-15×106cells/ml时，计算并转移所需体积细胞悬液于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，将细胞重悬于新鲜hi-kdcho培养液中，使其密度达到20×106cells/ml；

11、4)瞬时转染：将细胞转移至细胞培养摇瓶并放回摇床中，震荡培养1小时后从摇床中取出进行转染；转染时按浓度17μg/m将质粒dna添加至细胞中并充分摇匀，随后按浓度35μg/ml边添加转染试剂hikdcho-ta边混匀；

12、5)产物表达与检测：转染24小时后加入2％(2ml/100ml)的cho细胞蛋白表达增强剂hi-keplus；同时添加一次营养补充添加剂hikdcho-feed，添加量为2％(2ml/100ml)，并将细胞转移至32℃摇床培养箱中进行低温表达，以取得高表达效果；转染后第6-8天测定产物表达量；

13、6)蛋白纯化：使用ni smart beads 6ff重力柱(常州天地人和生物科技有限公司)纯化蛋白，并使用超滤管清洗掉咪唑，获得的蛋白纯度≥95％。

14、本发明优点在于：本发明提供的蛋白疫苗能有效应用于治疗因卵巢功能失调所引起的肥胖症、高血脂症、糖尿病等疾病，有望成为一种新型、有效、兼具防御和治疗的药物，具有宠物和动物绝育作用，可以治疗绝经期后妇女或做过绝育手术或去势手术的动物和宠物，以及因卵巢功能失调引起的肥胖症、高血脂症、高血糖等疾病的新型蛋白疫苗，具有很好的推广前景和医学经济价值。

技术特征：

1.一种适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗，其特征在于：针对多物种fshβ亚基的特异片段设计，涉及猪、牛、羊、羊驼、马的yetvkvpgcahhadsl片段，犬、貂的yetvrvpgcarhadsl片段，猪、牛、羊、羊驼、猫、兔、鼠的ypvatechcgk片段，人、猪、牛、羊、羊驼、犬、大熊猫、兔、鼠的cdsdstdctvrglgp，猫、虎、狮子的cdsdstdctvqglgp片段其中一个或多种组合，及其任意一段同源性>70％以上的序列。

2.根据权利要求1所描述的一种适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗，其特征在于：上述片段通过刚性接头a(eaaak)n序列连接起来。

3.根据权利要求2所描述的一种适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗，其特征在于：为增强免疫原性，在刚性接头序列两侧添加tev酶切序列enlyfqsa，使其与刚性接头a(eaaak)n融合后具备能使整个抗原形成稳定的二聚体的卷曲螺旋coiled coil结构，增加促溶肽以增强细胞表达，并在抗原c末端融合抗菌肽进一步增强免疫原性。

4.根据权利要求1-3任一项所描述的一种适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗的应用，其特征在于：以乳膏、油、软膏、粉末或凝胶形式进行局部使用。

5.根据权利要求1-3任一项所描述的一种适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗的应用，其特征在于：以口服、透皮、透粘膜、肌肉内、静脉内或皮下方式进行给药。

6.一种适用于多物种降脂降血糖去势的疫苗的制备方法，其特征在于，使用cho细胞表达系统，但不限于此表达系统的其它蛋白表达系统。

技术总结本发明公开了适用于多物种降脂降血糖去势的新型疫苗、制备方法及其应用，针对多物种FSHβ亚基的特异片段设计，涉及猪、牛、羊、羊驼、马的YETVKVPGCAHHADSL片段，犬、貂的YETVRVPGCARHADSL片段，猪、牛、羊、羊驼、猫、兔、鼠的YPVATECHCGK片段，人、猪、牛、羊、羊驼、犬、大熊猫、兔、鼠的CDSDSTDCTVRGLGP，猫、虎、狮子的CDSDSTDCTVQGLGP片段其中一个或多种组合，及其任意一段同源性>70％以上的序列。本发明优点：蛋白疫苗能有效应用于治疗因卵巢功能失调所引起的肥胖症、高血脂症、糖尿病等疾病，具有宠物和动物绝育作用，可以治疗绝经期后妇女或做过绝育手术或去势手术的动物和宠物，以及因卵巢功能失调引起的肥胖症、高血脂症、高血糖等疾病的新型蛋白疫苗，具有很好的推广前景和医学经济价值。技术研发人员：李涛受保护的技术使用者：北京诊都华宠科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4