一种蛋白聚合物及其生产工艺的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种蛋白聚合物及其生产工艺。

背景技术：

1、间充质干细胞(mesenchymal stemcells，mscs)具有自我复制和多向分化潜能，广泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎、脐带血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等组织，具有来源广泛、无需配型、感染率低、分化潜能强、增殖能力强、采集方便等特点，可产生干细胞生长因子(scf)、神经生长因子(ngf)、白介素-6(il-6)、白介素-7(il-7)、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素(ifn)等活性因子，参与调节细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、抗病毒、免疫成熟等过程，可用于免疫调节、组织修复及治疗急性肺损伤、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。

2、间充质干细胞在不同的刺激条件下培养，可以产生不同的应激蛋白，这些应激蛋白聚合物具有复杂的生理活性。如何利用mscs生产得到具有特定生物活性的蛋白聚合物，是一种非常具有挑战性的工作。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种蛋白聚合物及其生产工艺。

2、本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供：

4、一种蛋白聚合物，其生产工艺包括：

5、s1)培养间充质干细胞并使用紫外线照射制造应激环境；

6、s2)将间充质干细胞裂解，分离纯化得到蛋白聚合物；

7、所述蛋白聚合物满足如下特性中的至少一种：

8、1)分子筛排阻层析时，在流速为0.1～0.3ml/min、洗脱液为pbs的排阻层析条件下，第一组分出峰的洗脱体积为12～13.2ml、第二组分出峰的洗脱体积为15.2～17ml、第三组分出峰的洗脱体积为17～20ml、第四组分出峰的洗脱体积为29～31ml、第五组分出峰的洗脱体积为31～34ml；

9、2)sds-page检测时，使用4～20％预制胶进行样品分离检测，样品条带主要分布于11kd～100kd，其中分子量从大到小，第一条带位于75kd～100kd之间；第二条带位于63kd～75kd之间；

10、3)反相hplc检测时，在上样体积60～80μl、柱温25～40℃，流速0.5～1ml/min，检测波长220～280nm，流动相a为tfa水溶液，流动相b为tfa乙腈溶液，洗脱时间为6～150min的的反相hplc条件下，样品分离后出峰时间在10～40min之间，其中特征峰1出峰时间为13～17min，第二组样品组成成分出峰时间2～5min，特征峰2出峰时间为20～22min。

11、在一些蛋白聚合物的实例中，其至少包括如下蛋白：

12、sp|p02768|albu_human serum albumin os＝homo sapiens；

13、sp|p02787|trfe_human serotransferrin os＝homo sapiens。

14、优选的，上述2种蛋白质量占蛋白聚合物总质量的40％以上；

15、优选的，进一步包括如下蛋白中的至少一种：

16、sp|p51884|lum_human lumican os＝homo sapiens；

17、sp|p62736|acta_humanactin,aortic smooth muscle os＝homo sapiens；

18、sp|p01009|a1at_humanalpha-1-antitrypsin os＝homo sapiens；

19、sp|p07951|tpm2_human tropomyosin beta chain os＝homo sapiens；

20、sp|p08670|vime_human vimentin os＝homo sapiens；

21、sp|p02751|finc_human fibronectin os＝homo sapiens；

22、sp|p09493|tpm1_human tropomyosin alpha-1chain os＝homo sapiens；

23、sp|p21333|flna_human filamin-aos＝homo sapiens；

24、sp|p0dox5|igg1_human immunoglobulin gamma-1heavy chain os＝homosapiens；

25、sp|p24821|tena_human tenascin os＝homo sapiens；

26、sp|p01023|a2mg_humanalpha-2-macroglobulin os＝homo sapiens；

27、sp|p60709|actb_humanactin,cytoplasmic 1os＝homo sapiens；

28、sp|p69891|hbg1_human hemoglobin subunit gamma-1os＝homo sapiens；

29、sp|p01024|c3 human complement c3 os＝homo sapiens。

30、在一些蛋白聚合物的实例中，紫外线照射刺激间充质干细胞的时间为1～30h，优选的，照射时间为10～30h、更佳为6～18h；

31、优选的，紫外线照射刺激的强度为10～100μw/cm2，紫外线的波长优选为290～340nm；

32、优选的，紫外线照射刺激时使用的培养基为无血清mscs培养基。

33、在一些蛋白聚合物的实例中，分子筛排阻层析的操作包括：

34、平衡superdex 150分子筛8×500分子筛层析柱后，上样，使用pbs洗脱，洗脱速度优选为0.2～0.4ml/min，从280nm紫外吸收值4mau开始收集，洗脱收集洗脱体积为12～13.2ml、15.2～17ml、17～20ml、29～31ml、31～34ml的5种组分。

35、在一些蛋白聚合物的实例中，所述间充质干细胞选自脐带来源人间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、人胎盘来源间充质干细胞。

36、以上特征在不相冲突的情况下，可以任意组合。

37、本发明的第二个方面，提供：

38、一种蛋白聚合物的生产工艺，包括mscs扩增、使用紫外线照射培养液中的mscs，进行应激处理，收集应激处理后的mscs进行裂解处理，分离纯化蛋白得到蛋白聚合物。

39、在一些生产工艺的实例中，紫外线照射刺激间充质干细胞的时间为1～30h，优选的，照射时间为10～30h、更佳为6～18h；

40、优选的，紫外线照射刺激的强度为10～100μw/cm2，紫外线的波长优选为290～340nm；

41、优选的，紫外线照射刺激时使用的培养基为无血清mscs培养基。

42、在一些生产工艺的实例中，使用分子筛排阻层析分离纯化蛋白，优选的，所述分子筛排阻层析的操作包括：

43、平衡superdex 150分子筛8×500分子筛层析柱后，上样，使用pbs洗脱，洗脱速度优选为0.2～0.4ml/min，从280nm紫外吸收值4mau开始收集，洗脱收集洗脱体积为12～13.2ml、15.2～17ml、17～20ml、29～31ml、31～34ml的5种组分。

44、在一些生产工艺的实例中，hplc-sec分离纯化蛋白，操作包括：

45、使用反相液相色谱柱，流动相a为0.1％tfa的水溶液、流动相b为0.075％tfa的71.4％乙腈溶液，色谱条件为：

46、 时间(min) 流动相a(％) 流动相b(％) 流速(ml/min) 0 72 28 1.0 75 0 100 1.0 81 0 100 1.0 135 72 28 1.0 145 72 28 1.0

47、或色谱条件为：

48、 时间(min) 流动相a(％) 流动相b(％) 流速(ml/min) 0 72 28 1.0 75 0 100 1.0 81 0 100 1.0 81.1 72 28 1.0 90 72 28 1.0

49、或色谱条件为：

50、 时间(min) 流动相a(％) 流动相b(％) 流速(ml/min) 0 65 35 1.0 3 65 35 1.0 13 50 50 1.0 27 43 57 1.0 51 20 80 1.0 53 0 100 1.0 53.1 65 35 1.0 60 65 35 1.0

51、。

52、以上特征在不相冲突的情况下，可以任意组合。

53、本发明的第三个方面，提供：

54、本发明第一个方面所述蛋白聚合物的应用，所述应用包括用于制备治疗神经退行性疾病、脑卒中的药物。进一步的，所述神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默病(ad)、帕金森病(pd)、肌萎缩性侧索硬化(als)、不同类型脊髓小脑共济失调(sca)。

55、本发明的有益效果是：

56、本发明一些实例的蛋白聚合物，具有良好的细胞损伤修复作用，有望用于治疗神经退行性疾病、脑卒中，特别的，所述神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默病(ad)、帕金森病(pd)、肌萎缩性侧索硬化(als)、不同类型脊髓小脑共济失调(sca)。

57、本发明一些实例的生产工艺，可以有效克服不同批次mscs的差异，得到更为稳定、批间差异小的mscs，极大地保证了蛋白聚合物的质量和产量。

58、本发明一些实例的生产工艺，可以更好地保证脐带来源mscs和bmscs的活性，有利于提高mscs的原始获得量。

59、本发明一些实例的生产工艺，mscs的冻存和复苏活率高。

60、本发明一些实例的生产工艺，可以很好地分离纯化蛋白聚合物。