一种大体型黑水虻品系的建立方法

本发明属于生物，尤其是涉及一种大体型黑水虻品系的建立方法。

背景技术：

1、亮斑扁角水虻hermetia illucens l.属于双翅目、水虻科昆虫，俗称黑水虻，是一种重要的资源型昆虫。黑水虻的生长周期短，繁殖能力强，适合大规模人工养殖。黑水虻幼虫能处理多种复杂的有机废弃物，如禽畜粪便、食物残渣、农业生产肥料、堆肥渗滤液等。其幼虫蛋白含量高(约40％)，饲料-蛋白质转化效率高于传统的资源昆虫如大麦虫。目前，它已作为鱼粉和大豆粉饲料的替代品，是全球唯一被批准用作水产养殖和家禽饲料成分的昆虫物种。其幼虫还有丰富的油脂(约35％)与甲壳素，可用于生物燃料和生物膜生产。此外，黑水虻不携带和传播病原菌，不对环境和人类造成威胁。总之，黑水虻在替代资源和环境治理领域展现出巨大的应用价值。

2、在生物育种中，一种传统方法是可以通过人为筛选，经历数年针对特定表型的人工选择，从而获得相应优良表型的品系。但是这种方法耗时久，且受环境影响大，不宜应用在处于复杂废弃物环境的黑水虻。物理学方法如辐射诱变或者化学手段如诱变剂实现对基因的突变。但是这两种方法都存在靶基因目标不明确的缺点。目前新型的基因突变方法如crispr/cas9可以实现对单一基因进行操作实现基因突变的目的，具有目标清晰、不对其它基因造成影响的优点。通过已经建立的黑水虻显微注射平台，可实现对黑水虻基因组的遗传操作，因此开展生长发育相关基因的研究可以为获得大个体黑水虻品系提供一个理论和切实可行的方案。为进一步的进行新型品种的分子定向育种提供参考。

3、专利cn112111526a公开了一种筛选crispr/cas9基因编辑黑水虻的方法，其包括以下步骤：(1)将white基因敲除的模板引物sgrna1-f和sgrna2-f分别和通用的反向引物进行pcr，将pcr产物回收纯化，即得模板sgrna；(2)将所述的sgrna模板进行体外大量扩增，获得单链状态的sgrna；(3)将所述的单链状态的sgrna和cas9蛋白混合，显微注射入黑水虻新产受精卵中；(4)将所述注射后的卵黑暗处理，直到孵化，观察孵化出的黑水虻的眼色表型，挑出眼睛白化个体。基因编辑技术实现了眼色相关基因的成功敲除，获得的基因突变黑水虻可以通过观察是否出现白化眼睛来判断，表型早期易观察，作为标记基因具有优良效果，可以为后续黑水虻基因功能研究提供便捷。该方案是筛选crispr/cas9基因编辑黑水虻的方法。

4、专利cn117683818a公开了基于crispr/cas9基因编辑获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法及应用，包括如下步骤：a、sgrna制备：将黑水虻yellow基因外显子上的pam序列作为ngg的靶点，设计用于基因敲除的模板引物sgrna-f，扩增获得sgrna模板，而后以该sgrna模板大量扩增获取处于单链状态的sgrna；b、黑水虻胚胎显微注射及培养：将步骤a得到的sgrna和cas9蛋白混合后显微注射到刚产的黑水虻受精卵中，并置于培养箱中培养，得到表面为金黄色的黑水虻预蛹和蛹。该方案为获得黑水虻金黄色预蛹和蛹的方法。

5、目前，对于资源型可食用昆虫黑水虻的需求迅速增长。在全球食品工业中，每年产生约13亿吨有机废弃物，且在逐年增加，亟需黑水虻生物处理等经济环保可持续的方式进行处理。此外，面对动物饲料和宠物食品的昆虫养殖业也在不断发展，对昆虫蛋白供不应求，预计到2030年，全球需求量将增长50倍。因此，针对黑水虻产量需求的增加，扩大其生产规模，改进生产系统是常规方法；另一个角度即可使用低成本的生物育种手段，使虫子个体增大体重增加，提高昆虫自身的生产转化效率也可以取得良好的效果。

技术实现思路

1、基于现有技术中缺乏高效获得大体型黑水虻品系的现状，本发明提供一种大体型黑水虻品系的建立方法。

2、本发明采用基因编辑技术以获得大体型黑水虻品系，该方法突破了传统育种时间久、品系不稳定的屏障，可以更高效率的获得大体型黑水虻品系，以满足对黑水虻产量日益增长的需求，利用获得的大体型黑水虻品系可以更高效率的处理有机废弃物。

3、本技术方案的大体型黑水虻品系的建立方法，包括调控生长相关基因的克隆、靶点选择、基因靶点对应的sgrna的体外合成、胚胎显微注射、纯和突变体的筛选和生长发育表型观察。

4、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

5、本发明提供一种大体型黑水虻品系的建立方法，包括以下步骤：

6、s1、克隆获得生长发育相关的基因giant；

7、s2、在基因giant的单一外显子上选择pam序列为ngg的靶点；

8、s3、基于步骤s2确定的靶点，合成基因靶点对应的sgrna，分别为sgrna1和sgrna2；

9、s4、将sgrna和cas9蛋白混合注射进入刚产下的黑水虻胚胎中；

10、s5、培养注射后的黑水虻胚胎，饲养孵化出来的幼虫进行传代，通过自交筛选获得稳定变大的纯合突变品系，即为大体型黑水虻品系。

11、在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，所述生长发育基因giant的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体如下：

12、atgtttgatcgatttatgaaggatttgaatagtgcgaacaagatggcagtgtctgataatctagacgttttagatctctccaaacgacgtgattctgtagaaactcgaaaaacaccgtcaccttacaacacagcttctagccctgataccaattctccgaaaactagcccggatcagttatttgctttacaccaatcgaatatattaagtggaagctcatcgggagcacatccttctttgctatatccgcatccaaattattatcatcatccttcaaataatacaagcgaggagatatcagcactacgacgtatccaaagtttaccgatgtttccgacaaatggtgcatttccggcaagtcattttgatatcatcaaaactgcggcggcaatgcagcgtcaaacaatgaatgggatatcgatgtctccccattcccccacgttgccatcatgcgagtccaaagttgacgttgaggaaactattgatgtaggtacacccccaaatctgcgtccttccgtcttgtatccaattgttatgaaaaacgatggaaaggttgctcgccccttcaaggcatttccgcgtgaccctattgcaatggctgcaacatttacggcaacagatgcccttttggatgttgagaaggccgagaaatacagagcctttaggaaacgaatgctagatcagatgtacgaggcgaatggaggtagaccaacagtgaggaatccaaaaatgaggcgcggtcaggcaatcaaggaagaacaggcgaacgatagttgtagcagcagcgatgaccacaatttaaccaactctgatggaccagaaaacaataatggtgacaattgttctgtgatcagtcagaacggtttagttaaagacgctgcgtattatgagagacgcaagaagaataatgctgctgcaaaaaaatcaagggatcgaaggcggattaaagaagacgaaattgcagtgcgagcagcttttcttgaacatgaaaatattgaattgaggatcgaaatcgctgccatgaaaaaccaactggctctactaggagctagcgtgagtagataa。

13、在本发明的一个实施方式中，步骤s1中，首先提取黑水虻的rna，逆转录为cdna，通过设计引物g-f:atgtttgatcgatttatgaagg和g-r:gagctagcgtgagtagataa将基因giant从黑水虻cdna中克隆出来，连接在pjet-1.2载体上测序验证。

14、在本发明的一个实施方式中，步骤s2中，在基因giant的单一外显子上选择长度为23个碱基并且pam序列为ngg(5’-3’)的靶点。

15、在本发明的一个实施方式中，步骤s2中，两个靶点分别为靶点1和靶点2，靶点1(target site1)的序列为：5’ccttacaacacagcttctagccc 3’和靶点2(target site2)的序列为：5’ccacgttgccatcatgcgagtcc 3’。

16、在本发明的一个实施方式中，步骤s3中，sgrna1的模板引物为sgrna1-f和通用的反向引物，其中，sgrna1-f的核苷酸序列如seq id no.2所示，通用的反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

17、在本发明的一个实施方式中，步骤s3中，sgrna2的模板引物为sgrna2-f和通用的反向引物，其中，sgrna2-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，通用的反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。

18、其中，sgrna1-f:taatacgactcactatagggctagaagctgtgttgtagttttagagctagaaatagcaa；

19、sgrna2-f:

20、taatacgactcactataggactcgcatgatggcaacggttttagagctagaaa tagcaa，

21、反向引物为通用引物r:agcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttatttta acttgctatttctagct。

22、在本发明的一个实施方式中，步骤s3中，sgrna1的核苷酸序列如seq id no.5所示，sgrna2的核苷酸序列如seq id no.6所示。

23、sgrna1的核苷酸序列具体为：taatacgactcactatagggctagaagctgtgttgtagttttagagctagaaa tagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccga gtcggtgctttt。

24、sgrna2的核苷酸序列具体为：taatacgactcactataggactcgcatgatggcaacggttttagagctagaaa tagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccga gtcggtgctttt。

25、在本发明的一个实施方式中，步骤s4中，将合成好的sgrna1和sgrna2按照浓度150ng/ul与cas9蛋白的浓度300ng/ul混合。

26、在本发明的一个实施方式中，步骤s4中，用显微注射仪将sgrna和cas9蛋白混合注射进入刚产下的胚胎中。

27、在本发明的一个实施方式中，步骤s5包括：，

28、s5-1：先取15-20个未孵化的已注射受精胚胎提取基因组dna，在两个靶点上下游设计引物通过pcr检测基因组序列是否发生变化，通过pcr扩增得到的片段进行测序，确认是否实现giant基因敲除，若实现敲除，即进行后续步骤；

29、s5-2：s5-1后剩余的受精胚胎孵化后置于200g含水60％的麦麸度环境中饲养，并进行自交传代筛选获得纯合体后，观察统计幼虫生长发育状态，筛选确定获得体型增大且稳定遗传的品系。

30、在本发明的一个实施方式中，步骤s5-1中，突变检测引物分别为g-ts-f:gcgaacaagatggcagtgtc；g-ts-r:gcatctgttgccgtaaatgt。

31、与现有技术相比，本发明的优点体现在以下方面：

32、本发明采用基因编辑技术以获得大体型黑水虻品系，该方法突破了传统育种时间久、品系不稳定的屏障，可以更高效率的获得大体型黑水虻品系，以满足对黑水虻产量日益增长的需求，利用获得的大体型黑水虻品系可以更高效率的处理有机废弃物。