一种快速检测O型口蹄疫病毒的方法与流程

本发明属于分子生物学基因诊断，尤其涉及一种快速检测o型口蹄疫病毒的方法。

背景技术：

1、口蹄疫是一种由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,fmdv)引起的，可感染猪、牛、羊等70多种家养或野生偶蹄类动物的，急性、热性、接触性和高度传染性水疱病，被认为是危害偶蹄类动物的最重要的疾病之一。口蹄疫病毒fmdv是一种无包膜、正链单链rna病毒，属于小rna病毒科口蹄疫病毒属。

2、fmdv存在七种不同的血清型，包括o、a、c、亚洲1型和南非(southafricanterritories，sat)血清型sat1、sat2和sat3以及多种亚型，其中每个血清型又包括多个亚型，共有80多个。fmdv极不稳定，非常容易发生突变，而不同血清型之间并不能够产生交叉保护，甚至同个血清型下的不同亚型之间也仅能产生部分保护。

3、fmdv在全球范围内流行，严重危害着各国的生猪养殖产业。由于该病引起的水疱症状与sva、svdv等病原引起的症状相似，发病后易造成病情误判引起养殖主体紧张，进而恐慌性抛猪。因此，如何在发病现场快速鉴别诊断fmdv病原，是生猪养殖业亟需解决的痛点问题。

4、随着诊断技术的更新发展，多种检测技术被应用于猪群疫病，而fmdv的检测仍主要以荧光定量pcr、酶联免疫吸附测定、间接免疫荧光和免疫组化为主。这些方法需要良好的实验室条件、昂贵的专业仪器及经验丰富的技术人员，耗时耗力，难以应用于现场检测。

5、crispr/cas(clustered regulatory interspaced short palindromicrepeats/crispr-associate)是原核生物的一种获得性免疫系统，用于抵抗存在于噬菌体或质粒的外源遗传元件的入侵，为存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种防御机制，具有强大的基因编辑功能。crispr系统中的如cas12a、cas13a蛋白已被广泛应用于病毒检测领域。相较于与cas12a酶，cas13a酶在识别靶标序列时不需要依靠pam(protospaceradjacent motif)基序，cas13a与配对的crrna和目标rna结合后形成复合物并发生构象变化，激活rna酶切活性，可非特异性切割单链rna探针，产生荧光信号。通过荧光定量仪器对荧光信号进行收集，或者只使用蓝光透射仪观察反应后的产物，就能判定检测结果。有研究表明，cas蛋白的侧支切割活性在靶标浓度过低时显著降低。因此，提高靶标核酸量是改善该方法应用的重要前提。rt-raa检测技术对目标rna序列进行扩增，具有常温反应、检测快速、操作简单、灵敏度高等特点，但也易出现假阳性。rt-raa检测技术与crispr检测技术联用时能够利用rt-raa方法提升敏感性并利用crispr检测技术增加检测技术的特异性，使检测方法的敏感性与特异性都达到较高水平。但在实际操作中，基于rt-raa-crispr/cas13a检测经常出现假阳性或假阴性等问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测o型口蹄疫病毒的方法，即在筛选获得了一组高效特异性检测o型口蹄疫病毒的rt-raa引物探针的基础上建立的基于rt-raa-crispr/cas13a检测fmdv-o的方法。

2、本发明首先提供一种检测o型口蹄疫病毒的rt-raa引物对，所述的引物对，其检测的核酸片段的序列如下：

3、gaaattaatacgactcactatagggttaaatctcttggtcaaaccattactccagctgacaaaagcgacagaggttttgttcttggtcactcctttactgacttcactttcctcaaatgacacttccacatggattatggaactgggttttacaaac(seq id no:1)。

4、作为实施例的具体记载，所述的rt-raa引物对，其上下游引物对的序列信息如下：

5、上游引物fmdv-f6：5′-gaaattaatacgactcactatagggttaaatctcttggtcaaaccattactccag-3′(seq id no:2)、

6、下游引物fmdv-r6：

7、5′-gtttgtaaaacccagttccataatccatgt-3′(seq idno:3)。

8、本发明所筛选获得的rt-raa引物对用于制备用于检测o型口蹄疫病毒的rt-raa-crispr/cas13a检测制剂；

9、更进一步的，所述的检测制剂中还包含有rna荧光探针、cas13a蛋白和crrna；

10、所述的rna荧光探针，其序列为5′-uuuuuuuuuuu-3′，探针两端分别标记荧光基团fam和淬灭基团bhq1。

11、所述的crrna的序列如下：

12、aagtgaagtcagtaaaggagtgaccaaggttttagtccccttcgtttttggggtagtctaaatcccctatagtgagtcgtattaatttc(seq id no:4)。

13、本发明还提供了rt-raa-crispr/cas13a检测o型口蹄疫病毒的方法，包括以待测样品的crna为模板，采用上述rt-raa引物对进行rt-raa反应获得扩增产物；采用上述荧光探针和上述crrna对所述扩增产物进行crispr/cas13a反应获得反应产物；根据所述反应产物的荧光及荧光值确定待测样品是否含有o型口蹄疫病毒。

14、所述的反应产物的荧光确定待测样品是否含有o型口蹄疫病毒，在蓝光灯/紫外灯(波长为440-460nm/400nm)下观察所述反应产物，若反应产物产生绿色荧光，则待测样品含有o型口蹄疫病毒，若反应产物不产生色荧光，则待测样品不含有o型口蹄疫病毒。

15、本发明以rt-raa技术和crispr/cas13a技术结合，实现对fmdv-o临床样本的高灵敏度、高特异性、低复杂性的可视化检测。本发明还提供了一种操作简单、检测灵敏、结果可视化、低辅助设备需求的检测方法，从而为提高生猪养殖行业检测o型口蹄疫病毒，解决了因水疱性疫病临床症状相似，难以在疫病及检疫现场确诊fmdv，需要送实验室进行鉴别诊断的关键技术问题，降低生物安全风险提供了技术手段,为基层兽医部门进行疫病早期诊断与及时防控提供依据，对于防控该疫病的发生与流行具有重要意义。

技术特征：

1.一种检测o型口蹄疫病毒的rt-raa引物对，其特征在于，所述的引物对，其检测的核酸片段的序列为seq id no:1。

2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为seqid no:2，下游引物的序列为seq id no:3。

3.权利要求1或2所述的引物对在制备用于检测o型口蹄疫病毒的pcr检测制剂中的应用。

4.一种检测o型口蹄疫病毒的rt-raa-crispr/cas13a检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1或2所述的引物对。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含有rna荧光探针、cas13a蛋白和crrna。

6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的rna荧光探针的序列为5′-uuuuuuuuuuu-3′，探针两端分别标记荧光基团fam和淬灭基团bhq1。

7.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的crrna的序列为seq id no:4。

8.权利要求4所述的检测试剂盒在非疾病诊断治疗目的的检测o型口蹄疫病毒中的应用。

9.一种非疾病诊断治疗目的的检测o型口蹄疫病毒方法，其特征在于，示所述的方法是使用权利要求4所述的检测试剂盒进行检测，包括以待测样品的crna为模板，采用rt-raa引物对进行rt-raa反应获得扩增产物；采用荧光探针和上述crrna对所述扩增产物进行crispr/cas13a反应获得反应产物；根据所述反应产物的荧光及荧光值确定待测样品是否含有o型口蹄疫病毒。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的所述的反应产物的荧光确定待测样品是否含有o型口蹄疫病毒，在蓝光灯/紫外灯下观察所述反应产物，若反应产物产生绿色荧光，则待测样品含有o型口蹄疫病毒，若反应产物不产生色荧光，则待测样品不含有o型口蹄疫病毒。

技术总结本发明的目的是提供一种检测O型口蹄疫病毒的方法，即在筛选获得了一组高效特异性检测O型口蹄疫病毒的RT‑RAA引物探针的基础上，以RT‑RAA技术和CRISPR/Cas13a技术结合，实现对FMDV‑O临床样本的高灵敏度、高特异性、低复杂性的可视化检测。本发明还提供了一种操作简单、检测灵敏、结果可视化、低辅助设备需求的检测方法，从而为提高生猪养殖行业检测O型口蹄疫病毒，解决了因水疱性疫病临床症状相似，难以在疫病及检疫现场确诊FMDV，需要送实验室进行鉴别诊断的关键技术问题，降低生物安全风险提供了技术手段,为基层兽医部门进行疫病早期诊断与及时防控提供依据，对于防控该疫病的发生与流行具有重要意义。技术研发人员：沙洲,尼博,崔进,郑辉,李晨钰,董雅琴,张慧,房琳琳,刘爽,王晓华,戈胜强,魏荣受保护的技术使用者：中国动物卫生与流行病学中心技术研发日：技术公布日：2024/11/7