膀胱癌辅助诊断的体液外泌体长链非编码RNA生物标志物及其应用

本发明属于生物技术和肿瘤学领域，涉及膀胱癌患者体液(血浆和尿液)中外泌体lncrna生物标志物及表达量的检测方法，公开了一个用于诊断膀胱癌的血浆/尿液外泌体lncrna。

背景技术：

1、膀胱癌(bladder cancer)是起源于膀胱尿路上皮的恶性肿瘤，是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。全国肿瘤登记中心数据显示，2022年我国膀胱癌发病例数为9.29万，死亡例数4.14万，均居泌尿系统肿瘤首位。膀胱癌主要分为肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，mibc)和非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladdercancer，nmibc)，其中恶性程度高且预后差的mibc占膀胱癌总数的25-45％，约有25％的nmibc患者容易复发并进展为mibc，发生转移的mibc患者五年生存率仅有5-10％。由于膀胱癌早期诊断较为困难，诊疗手段疗效有限，其复发和进展较为常见的。膀胱癌的高发及年轻化不仅给患者带来严重的健康损害，也给家庭及社会带来沉重的精神和经济负担。

2、膀胱癌早期通常没有明显的特异性症状，这增加了早期诊断的挑战性。大量人群资料证实，对膀胱癌的早期确诊是有效降低其死亡率及提高生存率的关键方式。膀胱癌的诊断一般采用膀胱内镜检查、膀胱造影术和膀胱尿道超声内镜等技术。虽然膀胱内镜检查是膀胱癌筛查的金标准，但由于费用高昂、依从性差，严重影响膀胱癌早期发现和治疗。目前，一些肿瘤标志物检测(如癌胚抗原cea等)以及尿液细胞学检查等无创性筛查方法广泛用于膀胱癌的早期筛查。然而，各检测方法或存在灵敏特异度不足，或存在采样困难、检测技术难度大等问题，尚不能完全应用于大规模人群的筛查。因此，寻找能够鉴别早期膀胱癌的敏感且特异的生物标志物，对实现膀胱癌的早期预防、诊断和治疗至关重要。

3、近些年，外泌体(exosome)作为肿瘤发生发展的潜在生物标志物备受关注。外泌体是由正常或病理细胞内多囊泡体通过内吞作用形成的小囊泡，与胞膜融合并分泌到细胞外所形成的一群双层膜结构的囊性小泡，直径约在30～120nm之间。研究发现，泌体细胞(secretory cell)应激释放的外泌体通过近分泌、膜融合、配体-受体结合、吞噬等方式进入受体细胞(recipient cell)，释放所携带地来源于泌体细胞异常表达的生物活性物质，如mrna、非编码rna(lncrna、microrna、circrna等)、脂质等，影响受体细胞的生物学功能，进而参与疾病的发生发展。鉴于外泌体包含的生物活性物质体现了宿主细胞或起源组织的生理或病理变化，加之外泌体双层膜结构使其携带的内容物可长期稳定存在于血液、唾液、尿液等多种体液中；因此，外泌体携带的生物活性物质具有作为疾病诊断生物标志物的巨大潜力。

4、在外泌体包裹的众多生物活性物质中，长链非编码rna(long non-coding rna，lncrna)被认为是重要的效应分子，在近些年受到广泛研究。lncrna的转录本长度超过200个核苷酸，从转录前后等多个途径表观调控基因表达，可通过癌基因或抑癌基因样作用在人类多种恶性肿瘤中发挥重要作用。已有研究表明，lncrna在生理和病理(包括肿瘤)活动中主要有以下3大生物学特性：(1)定位广泛：lncrna可以存在于细胞核或细胞质中，具有不同的功能；(2)高丰度：lncrna在正常及肿瘤组织/细胞中广泛表达；(3)特异性强：某些lncrna在特定组织或细胞类型中表达丰富，显示出明显的组织特异性。以上数据表明，lncrna可在转录以及转录后水平发挥表观遗传调控，或结合转录因子顺式调控基因表达，或作为“海绵体”吸附mirna发挥竞争性内源rna(cerna)作用，参与肿瘤发生发展。

5、目前对于膀胱癌患者体液(血浆和尿液)外泌体中lncrna的研究较少，现有技术均没有涉及系统识别膀胱癌特异性体液(血浆和尿液)外泌体lncrna和评估其作为生物标志物的潜能。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于诊断膀胱癌患者的体液(血浆和尿液)外泌体lncrna生物标志物及其应用，综合评价其对于膀胱癌早期诊断的应用价值，为今后开发早期诊断膀胱癌非侵入性生物标志物提供理论依据，具有一定的临床实用价值。

2、本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

3、第一方面，本发明保护lncrna在制备膀胱癌筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断产品中的应用，其特征在于，所述lncrna为lncetbc。

4、第二方面，本发明保护检测lncrna含量或表达量的系统在制备膀胱癌筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断产品中的应用，其特征在于，所述lncrna为lncetbc。

5、在具体的实施方案中，所述检测lncrna含量或表达量的系统包括检测lncetbc含量或表达量的试剂和/或仪器。

6、优选的，所述检测lncetbc含量或表达量的试剂为检测lncetbc的引物和/或探针。

7、优选的，所述检测lncetbc的引物和探针如下：

8、forward primer：5'-cctccagcacctctacctgttg-3'，如seq id no：1所示；

9、reverse primer：5'-aggccccagggaatctttc-3'，如seq id no：2所示；

10、probe：5'-ccgatcacagccggaatgcagc-3，如seq id no：3所示。

11、更优选的，所述膀胱癌筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断产品还含有内参，具体如下：forward primer：5'-cacatggcctccaaggagtaa-3'，如seq id no：4所示；

12、reverse primer：5'-tgagggtctctctcttcctcttgt-3'，如seq id no：5所示；

13、probe：5'-ctggaccaccagccccagcaag-3，如seq id no：6所示。

14、优选的，所述膀胱癌筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断使用的检测样本为体液。

15、更优选的，所述体液为血浆和/或尿液。

16、优选的，所述产品可为试剂盒。

17、优选的，所述试剂盒中还含有说明书手册。

18、第三方面，本发明还保护一种膀胱癌筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断试剂盒，所述产品包含特异性检测lncetbc的引物和/或探针。

19、在具体的实施方案中，所述特异性检测lncetbc的引物和/或探针如下：forwardprimer：5'-cctccagcacctctacctgttg-3'，如seq id no：1所示；

20、reverse primer：5'-aggccccagggaatctttc-3'，如seq id no：2所示；

21、probe：5'-ccgatcacagccggaatgcagc-3，如seq id no：3所示。

22、在具体的实施方案中，所述试剂盒还含有内参，具体如下：

23、forward primer：5'-cacatggcctccaaggagtaa-3'，如seq id no：4所示；

24、reverse primer：5'-tgagggtctctctcttcctcttgt-3'，如seq id no：5所示；

25、probe：5'-ctggaccaccagccccagcaag-3，如seq id no：6所示。

26、有益效果

27、1.本发明首次揭示外泌体lncetbc在膀胱癌筛查或辅助筛查、诊断或早期诊断中可以作为一种新型的生物学诊断指标，该外泌体lncetbc具有稳定性好、灵敏性和特异性高的特点。本发明的体液外泌体长链非编码rna生物标志物的开发利用将为膀胱癌的筛查或辅助筛查、诊断或辅助诊断以及进一步的治疗提供新的方向。

28、2.本发明发现外泌体lncetbc在膀胱癌患者血浆和尿液中的表达水平均显著高于健康对照人群。这个结果将给未来研究膀胱癌的机制及针对外泌体lncetbc对于膀胱癌的治疗提供新的思路。