CBX3在制备诊断皮肤黑色素瘤、预测皮肤黑色素瘤预后和治疗皮肤黑色素瘤的药物中的应用

本发明涉及一种肿瘤治疗药物，尤其涉及黑色素瘤治疗药物。

背景技术：

1、黑色素瘤起源于表皮、粘膜和其他组织中的黑色素细胞。黑色素瘤的生长速度比任何其他实体瘤都要快，死亡率也较高，每年约有23万新病例和2万例死亡。皮肤黑色素瘤(skcm)是皮肤癌中死亡率最高的恶性肿瘤。尽管皮肤镜检查等现代诊断技术在很大程度上提高了皮肤黑色素瘤的诊断准确率，但目前皮肤黑色素瘤的诊断仍面临诸多挑战。诊断结果往往高度依赖医生的临床经验和专业知识，主观性较强，导致部分黑色素瘤病例出现误诊或漏诊。此外，诊断过程复杂且耗时、早期诊断的困难性、诊断成本较高也是限制一些患者及时接受检查和治疗的重要因素。在临床实践中，手术是大多数患者的治疗选择，然而对于晚期患者，因黑色素瘤具有高增殖、转移率的特性易导致治疗预后较差。基因治疗在近些年被逐渐重视，在多种疾病中被报道能有效改善患者预后，但对于黑色素瘤，目前还缺乏有效的分子靶标，限制了黑色素瘤的基因治疗技术研究进度，急需一种新的治疗靶标来研发可以改善患者预后的治疗方案。

2、chromebox蛋白同源物3(cbx3)，也被称为异染色质蛋白1γ(hp1γ)，是异染色质蛋白1家族的成员，可以沉默转录。cbx3被h3 lys-9三甲基化后，所在的染色质被转化为异染色质样(抑制状态)，被招募到紫外线诱导的dna损伤和双链断裂位点，从而影响细胞生长和发育。近期研究表明，cbx3参与细胞周期、细胞凋亡、免疫浸润等多种生物学过程，从而影响各种恶性肿瘤的进展，如肝癌、胰腺癌、透明细胞肾癌、乳腺癌等。

3、迄今为止，cbx3在皮肤黑色素瘤(skcm)中的作用尚不清楚，也尚未有以cbx3为治疗靶点进行皮肤黑色素瘤治疗的相关报道。因此，分析cbx3与skcm患者的相关性，构建cbx3敲低和过表达慢病毒载体，并进一步探讨cbx3在skcm细胞增殖、迁移等中的作用，具有潜在的临床应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供cbx3在制备诊断皮肤黑色素瘤、预测皮肤黑色素瘤预后和治疗皮肤黑色素瘤的药物中的应用，以解决现有技术中皮肤黑色素瘤诊断技术复杂、预后评估困难、治疗方式单一等问题。

2、为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：

3、cbx3在制备诊断皮肤黑色素瘤或预测皮肤黑色素瘤预后的产品中的应用。

4、进一步地，所述产品包括用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或基因芯片技术诊断皮肤黑色素瘤或预测皮肤黑色素瘤预后的产品。

5、本发明还提供cbx3在制备治疗皮肤黑色素瘤药物中的应用。

6、本发明还提供一种cbx3敲低慢病毒的构建方法，构建过程为：合成cbx3干扰靶点序列cdna片段，对慢病毒载体的bamhi/ecori位点酶切，然后将cbx3干扰靶点序列cdna片段插入酶切后的线性化慢病毒载体，得到cbx3敲低慢病毒载体；将cbx3敲低慢病毒载体、慢病毒包装辅助载体pspax 2和慢病毒包装辅助载体pmd2.g与opti-mem混合均匀温育，得到稀释后的三种载体；将lipofectamine 2000试剂与opti-mem混合温育，得到稀释后的lipofectamine 2000；把稀释后的三种载体与稀释后的lipofectamine 2000快速混匀，形成三种载体与lipofectamine 2000稀释液的转染复合物，所述转染复合物与细胞孵育，然后培养转染cbx3敲低慢病毒后的细胞，提纯浓缩细胞上清液，得到cbx3敲低慢病毒浓缩液。

7、进一步地，所述cbx3干扰靶点序列的正向序列如seq id no.1所示，其反向序列如seq id no.2所示。

8、进一步地，所述cbx3敲低慢病毒载体、慢病毒包装辅助载体pspax 2和慢病毒包装辅助载体pmd2.g抽提质粒dna的a260/a280均在1.8～2.0之间；

9、所述细胞是人胚肾细胞293t细胞；

10、进一步地，所述cbx3敲低慢病毒的构建过程中，转染前24h，消化细胞，调整细胞密度37℃、5％co2培养24h，转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基，将fv055-cbx3敲低慢病毒载体、慢病毒包装辅助载体pspax2、慢病毒包装辅助载体pmd2.g与opti-mem混合均匀，在室温下温育5分钟；将lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取其与2.4ml opti-mem混合，在室温下温育5分钟；把稀释后的三种载体与稀释后的lipofectamine 2000在5分钟之内混合，然后在室温下温育2分钟，以便形成三种载体与lipofectamine 2000稀释液的转染复合物；将三种载体与lipofectamine 2000稀释液的转染复合物转移至含细胞的培养液中混匀，于37℃，5％co2培养培养8h后洗涤，加入培养基，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48h、72h，分别在48h、72h收集细胞上清液，提纯浓缩得到病毒浓缩液于-80℃长期保存。

11、进一步地，转染前24h，消化对数生长期的人胚肾细胞293t细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2×107细胞/20ml，接种于细胞培养皿37℃、5％co2培养，24h后待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；将fv055-cbx3敲低慢病毒载体10μg，慢病毒包装辅助载体pspax210μg，慢病毒包装辅助载体pmd2.g 10μg，与相应体积opti-mem混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟；将lipofectamine 2000试剂100μl与2.4ml opti-mem混合，在室温下温育5分钟；把稀释后的三种载体与稀释后的lipofectamine 2000在5分钟之内轻轻地颠倒混匀，期间不要振荡；混合后，在室温下温育2分钟，形成三种载体与lipofectamine2000稀释液的转染复合物；将三种载体与lipofectamine 2000稀释液的转染复合物转移至含293t细胞的培养液中混匀，于37℃，5％co2培养8h后倒去含有转染复合物的培养液，洗涤；每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48h；收集293t细胞上清液于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中，4000×g离心至需要的病毒浓缩体积；将过滤杯的cbx3敲低慢病毒转移到样品收集杯中，得到cbx3敲低慢病毒的病毒浓缩液，并将病毒浓缩液于-80℃长期保存。

12、本发明还提供一种所述的构建方法得到的cbx3敲低慢病毒。

13、本发明还提供一种所述的cbx3敲低慢病毒在制备治疗皮肤黑色素瘤药物中的应用。

14、本发明的优点包括：治疗skcm提供了一种新的靶点，有望针对该靶点筛选和制备出有效治疗skcm的新药物，为有效降低skcm细胞的增殖和迁移运动能力，为开发治疗skcm药物提供新方向。