一株兼具生防和调水功能的贝莱斯芽孢杆菌D34及其应用

本发明涉及微生物，具体涉及一株兼具生防和调水功能的贝莱斯芽孢杆菌d34及其应用。

背景技术：

1、气单胞菌是一类广泛存在于养殖水环境中的条件致病菌，是我国淡水养殖动物爆发性疫病的主要细菌性病原之一，可引起鱼类细菌性败血症、蛙类红腿病、鳖类腮腺炎等。在现在的这种高密度集约化养殖模式中，鱼类的残饵、粪便等大量积累，不仅导致水体有毒物质氨氮和亚硝酸盐严重超标，污染水质，而且会促进病原气单胞菌大量繁生，引起病害频发，每年给水产养殖行业造成重大的经济损失。鳃霉病是一种危害严重的鱼类真菌性疾病，由鳃霉感染鱼类鳃丝所引起，而鳃霉属鞭毛菌亚门，水霉目，鳃霉属；目前已报道的病原鳃霉主要有两种：血鳃霉和穿移鳃霉，以游动孢子形式传播感染，依赖菌丝寄生。鳃霉菌孢子附着鱼类鳃上皮后不断生长，发育成菌丝，菌丝上往往附着有游动孢子囊，游动孢子囊内成熟后的游动孢子会破壁而出，释放到鳃小片中，发育成新的菌丝，菌丝紧贴毛细血管并堵塞整个窦状毛细血管的管腔空间，使鳃小片肿大、充血、出血。鳃霉对寄主没有选择性，草鱼、青鱼、鳙、鲮、鲤、鲫、鳊、黄颡鱼等均可感染，以鲮鱼最敏感, 受害最严重。鱼类鳃部受到寄生虫或其他理化因子刺激创伤后常导致鳃霉的继发性急性感染，病鱼会表现为没有食欲，呼吸困难，爆发性死亡，感染死亡率一般在50%以上，发病严重时死亡率最高可达100%。由于鳃霉感染致病部位的特殊性，鳃霉病原分离纯化十分困难，至今尚缺少安全有效的鳃霉防控药物。

2、现有技术中，对于水产病害防控与水质调节的方法，主要有物理方法、化学方法和生物方法。其中物理方法效果非常有限；而广泛使用抗生素及化学药剂的化学防治手段不仅引起病原菌抗药性问题，而且导致养殖水产药物残留问题，制约水产品贸易，严重影响水产养殖业的可持续发展；采用生物防治手段控制，能够有效减少药物残留，避免抗药性产生，是目前重点推广的方式。已报道的用于水产动物病害生物防控与水质调节的微生物主要有：光合细菌、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、硝化细菌等，其中芽孢杆菌因具有耐热、易保存、生命力强等特点应用最广泛。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一株兼具生防和调水功能的贝莱斯芽孢杆菌d34及其应用。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案之一：

3、一株兼具生防和调水功能的贝莱斯芽孢杆菌d34，其保藏编号为cctcc no:m2019457，其保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期是2019年6月17日。该菌株对鱼类病原鳃霉有抑制作用、对鱼类抗病原气单胞菌感染具有保护效果、对养殖水体有毒物质氨氮和亚硝酸盐有很好的降解作用。

4、上述贝莱斯芽孢杆菌d34的生物学特征如下：（1）：lb平板上30℃培养24h的d34菌落呈圆形、直径4.2mm-4.6mm、乳白色、表面光滑、中间有褶皱稍微隆起、不透明，边缘不规则；培养48h后表面凸起，形成多芒星状褶皱，挑取菌落时肉眼可见粘稠状拉丝；革兰氏染色呈阳性，菌体长杆状，大小为1.6μｍ×0.5μｍ；培养液静置3d可在表面形成一层白色生物膜；（2）d34菌能利用蔗糖和葡萄糖，硝酸盐（还原）、精氨酸和鸟氨酸结果呈阳性，阿拉伯醇、肌醇、甘露醇、麦芽糖、乳糖、半乳糖、氨基酸对照及硫化氢结果呈阴性。

5、上述贝莱斯芽孢杆菌d34的筛选过程如下：

6、步骤1）：供筛选的57株芽孢杆菌是按常规方式从健康养殖水体底泥中分离获得；而用于初筛和复筛的指示病原菌为气单胞菌；

7、步骤2）：将供筛选的芽孢杆菌接种于lb平板，于28℃培养24h后转接至lb液体培养基，28℃振荡培养24h，用灭菌枪吸取适量菌液滴于空白药敏纸片上，自然晾干备用，获得初筛药敏纸片；然后以鲫鱼源病原菌气单胞菌为指示菌，将指示菌接种于lb平板，置于恒温培养箱28℃培养24h后，用灭菌的枪头刮取适量菌苔，加入盛有1ml无菌水的离心管中，吸打均匀，制备菌悬液，吸取100 μl菌悬液均匀涂布于lb平板上，再将初筛药敏纸片均匀贴于该lb平板上，28 ℃共培养48 h后，观察并筛选出具有明显抑菌圈的生防芽孢杆菌；

8、步骤3）：将经过步骤2）初筛的芽孢杆菌接种至lb平板，28℃培养24 h，然后转接至lb液体培养基，选择28 ℃、150 r/min连续振荡培养24 h，或是选择28 ℃静置培养过夜后，150 r/min连续振荡培养7 h；然后取培养液离心，接着取适量离心后的上清液滴于空白药敏纸片上，自然晾干备用，获得复筛药敏纸片；分别以中华鳖源、草鱼源、鲢鱼源病原菌气单胞菌为指示菌，制备菌悬液涂布lb平板，然后采用复筛药敏纸片分别贴于前述三种病原菌的lb平板上，30℃共培养48 h，观察抑菌圈大小，筛选出对气单胞菌有广谱抑制作用的生防芽孢杆菌。

9、本发明提供的技术方案之二是提供一种含有贝莱斯芽孢杆菌d34芽孢的微生态制剂。

10、本发明提供的技术方案之三是提供贝莱斯芽孢杆菌d34的培养方法，具体是接种到发酵培养基中进行培养，其中发酵培养基成分为：酵母浸粉5.0 g/l、生黄豆粉15.0 g/l、氯化钠10.0 g/l、硫酸镁8.0 g/l。

11、优选地，上述培养条件为25-35℃、180-220 r/min振荡培养。

12、优选地，上述培养条件为：30℃、5% 接种量、转速220 r/min发酵培养d34芽孢杆菌48 h。

13、本发明提供的技术方案之四是贝莱斯芽孢杆菌d34或其发酵物或发酵提取物、含有贝莱斯芽孢杆菌d34芽孢的微生物制剂在水产养殖中对鱼类病原菌气单胞菌、鳃霉防控的应用，以及在养殖水质调节方面的应用。

14、本发明至少具备如下有益效果：

15、本发明筛选获得的一株对气单胞菌和鳃霉具有拮抗作用的生防芽孢杆菌d34，对哺乳动物皮肤没有感染作用，对草鱼鱼苗没有毒性，具有较好的生物安全性；d34菌发酵培养基与发酵条件优化结果显示：以酵母浸粉5.0 g/l、生黄豆粉15.0 g/l、氯化钠10.0 g/l、硫酸镁8.0 g/l为配方，5% 接种量、30℃、转速220 r/min发酵培养48 h 获得最高的芽孢数为2.03×109 cfu /ml，芽孢率达96.50%。d34菌对鳃霉菌丝生长的抑制率达61%-77%，对鳃霉孢子萌发有很好的抑制作用，抑菌圈直径达25 mm；对草鱼夏花抗维氏气单胞菌病原感染具有明显的保护作用，试验组草鱼夏花 48 h 成活率提高了51.7%-53.3%；对不同来源养殖水体中氨氮与亚硝酸盐均有一定的降解效果，大塘试验结果表明，芽孢杆菌d34对池塘亚硝酸盐降解效果快速且较持久，有望作为微生物水质调节剂的候选菌株。

技术特征：

1.一株兼具生防和调水功能的贝莱斯芽孢杆菌d34，其分类命名为bacillus velezensis d34，其保藏编号为cctcc no:m 2019457，其保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期是2019年6月17日。

2.含有权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌d34芽孢的微生物制剂。

3.贝莱斯芽孢杆菌d34的培养方法，其特征在于，将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌d34接种到发酵培养基中进行培养，其中发酵培养基成分为：酵母浸粉5.0 g/l、生黄豆粉15.0 g/l、氯化钠10.0 g/l、硫酸镁8.0 g/l。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，培养条件为25-35℃、180-220 r/min振荡培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，培养条件为：30℃、5%接种量、转速220 r/min发酵培养d34芽孢杆菌 48 h。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌d34或其发酵物或发酵提取物、权利要求2所述的微生物制剂在水产养殖中对鱼类病原菌气单胞菌、鳃霉防控的应用，以及在养殖水质调节方面的应用。

技术总结本发明公开了一株兼具生防和调水功能的贝莱斯芽孢杆菌D34及其应用，所述D34的保藏编号为CCTCC NO:M 2019457，其保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期是2019年6月17日。该菌株对鱼类病原鳃霉有抑制作用、对鱼类抗病原气单胞菌感染具有保护效果、对养殖水体有毒物质氨氮和亚硝酸盐有很好的降解作用。技术研发人员：罗玉双,邹万生,陈中元,王荣华,寻晴,周芳颖,程万,陈海琳,卢颖,俞涛受保护的技术使用者：湖南文理学院技术研发日：技术公布日：2024/11/14