一株基因工程菌及其构建方法和应用

本发明涉及基因工程，具体是一株基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、随着工业化不断发展，世界对石油这一战略性资源的需求日益增加。但由于石油在井喷、运输、储存及加工过程中的泄露，产生了大规模的石油污染土壤。我国油田所产原油大多为含石蜡原油，据统计，我国约有90%原油的石蜡含量达到了20%~40%。石蜡主要是由碳链长度为18~30的长链正构烷烃组成，原油泄露后将导致土壤中的长链烷烃含量较高，而长链烷烃在土壤中不易回收，将造成土壤污染。因此，提高长链烷烃的降解效率在修复石油污染土壤过程中尤为重要。

2、目前发现的长链烷烃降解酶主要有alkb、cyp153、alma和lada，自从throne-holst等通过基因敲除及基因互补实验证明了alma的编码基因 alma参与了c32及更长的长链正构烷烃降解后（throne-holst m, wentzel a, ellingsen te, et al. identification ofnovel genes involved in long-chain nalkane degradation by acinetobactersp.strain dsm 17874 [j]. applied microbiology and biotechnology, 2007, 73: 3327–3332.）， alma便被作为长链烷烃降解中的代表性基因得到广泛研究，通常认为其是一种烷烃羟化酶的编码基因，参与了长链烷烃的末端羟基化过程（wentzel a, ellingsen te,kotlar h-k, et al. bacterial metabolism of long-chain n-alkanes[j]. appliedmicrobiology and biotechnolog, 2007, 76: 1209–1221.）。wang等通过异源表达和q-pcr技术手段证明了 alcanivorax hongdengensisa-11-3中的 alma编码了一种烷烃羟化酶，可参与长链烷烃的末端羟基化过程（wang wp, shao zz. genes involved in alkanedegradation in the alcanivorax hongdengensisstrain a-11-3 [j]. appliedmicrobiology and biotechnology, 2012,94:437–448.）。li等人对 pseudomonas  aeruginosadn1中的分解代谢基因的表达情况及降解底物进行了研究，发现 alma仅在c20以上的烷烃中其mrna水平显著增加，其中底物为c32时增幅最大；分别敲除 alma1及 alma2后，菌株在链长长于32的烷烃上生长受到了抑制，证明 alma1及 alma2编码了一种烷烃羟化酶，可参与c32及更长的长链正构烷烃降解（li yp, pan jc, ma yl. elucidation of multiplealkane hydroxylase systems in biodegradation of crude oil n-alkane pollutionby pseudomonas aeruginosadn1 [j]. journal of applied microbiology, 2019,128:151-160.）。

3、活不动杆菌（ acinetobacter vivianii）kj-1是从齐鲁工业大学（山东省科学院）彩石校区附近某加油站周围的汽油、柴油污染土壤分离出的一株正十二烷降解菌，具有较强的柴油降解能力。目前，活不动杆菌kj-1已经完成了全基因组测序，通过比对发现该菌基因组中存在 av-alma基因。 av-alma基因与现有的 alma基因具有序列相似性，但不同属间的alma可能具有独特的进化起源和不同的功能。因此，本发明拟探究 av-alma基因的具体功能，为其今后的应用奠定基础。

4、目前，常将目的基因导入受体菌中构建基因工程菌来研究目的基因的功能。部分受体菌为野生型细菌，在进行分子生物学操作时不同于模式大肠杆菌，常规的热激转化法可能无法满足构建工程菌的要求，并且大量开发的适用于模式大肠杆菌的表达载体可能不适用于野生型细菌。考虑到构建的基因工程菌需要具备较好的生态安全性及稳定性，且防止表达载体在细菌传代过程中丢失从而造成环境污染，这就对转化方法及载体的选择提出了更高的要求。

5、三亲接合转化法是通过供体菌、受体菌、辅助菌间的直接接触，利用载体间的接合转移功能，使得供体菌中含有目的基因的重组转座子载体转移至受体菌中。put/mini-tn5km转座子载体具有将目的基因整合至受体基因组的功能，该载体具有的orir6k复制子仅在含有由pir基因产生的π蛋白的情况下才可以复制，当含有目的基因的重组转座子载体进入受体菌后，由于受体菌不能产生π蛋白，失去了目的基因的载体将由于不能自身复制则会随着受体菌的不断增殖最终在受体菌中消失。三亲接合转化法不再需要额外添加抗生素，且杜绝了表达载体进入自然环境后所造成的污染，保证了基因工程的稳定性及安全性。

技术实现思路

1、本发明提供了一株基因工程菌，使用质粒put/mini-tn5 km作为转座子载体，通过三亲接合转化法将 av-alma基因导入到乙酸钙不动杆菌（ acinetobacter calcoaceticus）21#（保藏编号cgmcc no.31080）中，成功获得了一株石油烃降解基因工程菌，该基因工程菌对长链烷烃正二十八烷、脂肪酮2-癸酮和2-十二酮表现出了较高的降解活性，在修复石油污染土壤方面具有广阔的应用前景。

2、本发明技术方案如下：

3、一株基因工程菌，是一株表达氨基酸序列如seq id no.2所示的 av-alma酶的重组乙酸钙不动杆菌（ acinetobacter calcoaceticus）21#。

4、所述基因工程菌的构建方法，是将 av-alma基因导入到乙酸钙不动杆菌21#中获得，所述 av-alma基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述乙酸钙不动杆菌21#的保藏编号cgmcc no.31080。

5、优选的，所述导入的方法为，使用转座子载体，通过三亲接合转化法将 av-alma基因导入到乙酸钙不动杆菌21#中。

6、优选的，所述转座子载体为质粒put/mini-tn5 km。

7、优选的，所述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

8、（1）扩增目的基因 av-alma；

9、（2）构建含有目的基因的重组质粒；

10、（3）将重组质粒中的目的基因与转座子载体连接，构建含有目的基因的重组转座子载体；

11、（4）通过三亲接合转化法将重组转座子载体导入到乙酸钙不动杆菌21#中。

12、所述基因工程菌在降解长链烷烃、降解脂肪酮中的应用。

13、优选的，所述长链烷烃为正二十八烷。

14、优选的，所述脂肪酮为2-癸酮、2-十二酮。

15、所述基因工程菌在修复石油污染土壤中的应用。

16、优选的，所述石油污染土壤中包括烷烃、芳香烃、胶质、沥青质。

17、进一步优选的，所述石油污染土壤中的石油浓度为1~5%（w/w）。

18、有益效果：

19、本发明使用质粒put/mini-tn5 km作为转座子载体，通过三亲接合转化法将 av- alma基因导入到乙酸钙不动杆菌21#（保藏编号cgmcc no.31080）中，成功获得了一株石油烃降解基因工程菌，该基因工程菌对长链烷烃正二十八烷、脂肪酮2-癸酮和2-十二酮表现出了较高的降解活性，在修复石油污染土壤方面具有广阔的应用前景。