一种基于乙酸盐与甘油组合预处理的生物质高效转化产油脂的方法

本发明属于木质纤维类生物质生物炼制，尤其涉及一种基于乙酸盐与甘油组合预处理的生物质高效转化产油脂的方法。

背景技术：

1、生物质能源是指利用生物质作为原料，通过化学或生物转化方式，将其转化为热能、电能或燃料等形式的能源。与化石能源相比，生物质能源具有循环可再生、低碳排放、易获取等优势，被认为是一种可持续发展的能源。木质纤维类生物质是地球上最丰富的可再生资源之一。已被广泛应用于能源、化工、材料等领域。木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，蕴含着大量的碳水化合物资源。将生物质中的纤维素和半纤维素水解为可发酵性糖，进一步通过微生物转化为生物燃料和化学品，是当前的研究热点之一。

2、相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，是极具潜力的新型油脂资源。其用途广泛，可以作为保健品、食品、油脂化学品和生物柴油的原料。利用生物质制备微生物油脂需要经过几个步骤：预处理、酶水解、油脂发酵和油脂提取。利用廉价的木质纤维类生物质制备微生物油脂，有望大幅度降低原料成本，使商业化成为可能。

3、由于生物质中的纤维素、半纤维素和木质素紧密缠绕在一起，具有很强的抗降解性。因此，需要先经过物理、化学、物理化学或生物的方法进行预处理破坏木质纤维素材料的顽固性结构，降低木质纤维素的结晶度、增加原料的孔隙率、提高酶的可及度和脱除木质素的保护作用，最终提高纤维素酶的可及性。目前预处理成本较高，且剧烈的预处理过程往往还会产生对后续发酵有负面影响的抑制性因子，这些都阻碍其商业化。

4、其中有些化学预处理技术，由于其所用的介质或者溶剂在预处理结束后，可以作为微生物的营养源如碳源氮源等，甚至用于调节后续微生物培养基的组成使得培养基更加有利于后续发酵生产目标产品，而受到人们的关注。

5、当利用甘油作为碳源时，由于其还原性较高，可以作为优质碳源用于油脂生产。在制备微生物油脂的代谢途径过程中，可以将多余的nadh循环转化为nadph，会使甘油经过糖酵解到肪酸的生物合成的通量显著增加，而经过ppp途径的通量急剧下降。从甘油到乙酰辅酶a的代谢过程中产生了额外的fadh2，这意味着通过me可以产生更多的nadph，从而得到更高的脂质产率。乙酸盐在大多数情况下被认为是一种发酵抑制性因子，当含乙酸的培养基ph被调成中性或者弱碱性后，其主要以乙酸根离子形式存在，毒性大大下降。此外，乙酸盐可以直接通过乙酰辅酶a合成酶催化为乙酰辅酶a，作为脂肪酸合成的前体进而合成油脂。代谢通量分析发现，当乙酸和甘油共利用时，产油酵母理论油脂得率显著提高。

6、甘油基预处理技术目前被广泛应用于木质纤维素的预处理。乙酸、乙酸钠、乙酸钾等化合物，由于其酸/碱性，具有破坏木质纤维素生物质结构的潜力。因此，当乙酸盐和甘油混合物作为预处理介质时，可能具有非常好的预处理效果。进一步地，利用富含碳源的预处理液和酶水解液发酵产油脂，降低成本的同时有效提高油脂生产效率，实现资源再利用。

技术实现思路

1、基于上述论述，本发明的目的在于提供一种基于乙酸盐与甘油组合预处理的生物质高效转化产油脂的方法，旨在建立一种将碳源介导的预处理与微生物油脂生产相结合的策略，来提高糖产量和油脂产量，为将木质纤维素生物质转化为有价值的产品提供了一种新的技术路线。

2、所述通过乙酸盐与甘油组合预处理的生物质高效转化产油脂的方法包括下述步骤：

3、步骤s1：将木质纤维素生物质通过碳源组合预处理，固液分离后得到固相和液相，其中固相加水洗涤至中性；

4、步骤s2：液相加洗涤水稀释，并调整ph值，作为发酵培养基，灭菌待用；

5、步骤s3：将预处理后的生物质固相置于酶解反应器中，调整固液比后加入纤维素酶，添加适量tween 80，启动酶水解。水解结束后固液分离获得含糖水解液，并调整ph值，作为发酵培养基，灭菌待用；

6、步骤s4、将产油微生物接种于种子培养基中培养，制备产油微生物种子液，将产油微生物种子液接种至步骤s2和s3所述发酵培养基中培养，当发酵培养基中碳源浓度低于设定阈值时，结束发酵；

7、步骤s5、将步骤s2和步骤s3中的发酵培养基任意比例混合，灭菌待用；将产油微生物种子液接种至此混合发酵培养基中培养，当发酵培养基中碳源浓度低于设定阈值时，结束发酵；

8、步骤s6、固液分离收集含油菌体，提取胞内油脂。

9、具体的，步骤s1中，所述木质纤维素生物质为玉米秸秆、小麦秸秆、稻草、甘蔗渣、竹子、棉花秸秆或油菜秸秆。

10、具体的，步骤s1中，预处理化学试剂为甘油、乙酸、乙酸钠、乙酸钾、或其主要成分为甘油和乙酸的廉价原料。

11、具体的，步骤s1中，乙酸或乙酸盐含量为0.1～3g/g干物质，甘油含量为30～90wt％，生物质固液比为10～20wt％，这里wt为质量比。预处理温度为120～230℃，预处理时间为0.25～2.5h。

12、具体的，步骤s2中，所述ph的调节范围为6～7.0。

13、具体的，步骤s3中，酶解初始固液比为5～20％(w/v)，这里w/v为质量体积比。按照5～20fpu/g加入纤维素酶，酶水解ph范围为4.5～5.5。

14、具体的，步骤s3中，tween 80的添加量为10～50mg/g干物质，tween 80的添加可以减少酶用量和缩短酶水解时间，提高酶水解的效果。

15、具体的，步骤s4和s5中，所述产油微生物种子液体积占混合培养基体积的2～20％，培养温度控制在30～34℃之间。

16、具体的，步骤s4和s5中，所采用的毛孢子油脂酵母或者弯曲隐球酵母可以使用从菌种保藏机构购买或从自然界中分离的菌株，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。

17、具体的，步骤s6中，抽提所获油脂为一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂，适合作为生物柴油的原料。

18、本发明的有益效果是：

19、1、选用乙酸盐和甘油组合预处理，可以显著破坏生物质的结构，显著提高酶解糖得率，预处理后的乙酸和甘油可以作为产油酵母的碳源，用于油脂的生产。产油酵母同时利用乙酸和甘油，比单独利用时，油脂生产效率和得率显著增加。

20、2、木质纤维素原料预处理液中会有一些毒性物质的存在影响后续酶解效率和一般产油微生物的发酵产油脂效率，而本发明通过稀释预处理液，无需通过脱毒就可以进行生产油脂。

21、3、本发明中，通过碳源组合进行预处理，将木质纤维素原料的天然结构破坏，不仅对后续酶水解效果有很大提升效果，同时也对液相中残留的化学试剂进行了利用，用来产生微生物油脂，实现了“变废为宝”。这一过程不仅解决了木质纤维素原料预处理程中产生的毒副产物的去向问题，还进一步提高了木质纤维素原料的碳源利用率，实现了可持续发展和经济效益，还更加符合绿色环保的理念；

22、4、旨在建立一种将碳源介导的预处理与微生物油脂生产相结合的策略，来提高糖产量和油脂量，为将木质纤维素生物质转化为有价值的产品提供了一种新的技术路线。

23、本发明所采用的方法非常容易实现，显著简化了工艺流程、降低了设备成本、提高了油脂的生产效率，提升了微生物油脂生产的技术经济性，具有广阔应用前景，本发明所获油脂为一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂，可用于制备生物柴油或其他高附加值产品，具有非常好的应用价值。