一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法与流程

本发明涉及口蹄疫灭活疫苗生产领域，尤其涉及一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法。

背景技术：

1、在口蹄疫灭活疫苗生产中，纯化口蹄疫灭活抗原时，需要用聚乙二醇6000除去中间品中的杂蛋白，以提高口蹄疫灭活疫苗的146s抗原的含量，因此也产生了口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留问题。如果聚乙二醇6000残留量偏高，可导致口蹄疫灭活疫苗产生沉淀，在对口蹄疫灭活疫苗稳定性产生严重影响的同时，也会对免疫动物产生一定的副反应等问题。

2、目前，口蹄疫灭活疫苗国家标准没有规定测定聚乙二醇6000残留量的方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、高效、准确的微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法。

2、为解决上述问题，本发明所述的一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法，包括以下步骤：

3、⑴采用正戊醇对口蹄疫灭活疫苗样品进行破乳，即得水相抗原；所述水相抗原用三氯乙烯和去离子水进行除脂和稀释处理后，即得处理后的水相抗原；

4、⑵精密量取10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml聚乙二醇6000系列对照品溶液和处理后的水相抗原各200µl至2ml离心管中，每管加入浓度为0.5mol/l的高氯酸溶液1.0ml，混匀，室温放置15分钟，4000rpm离心10分钟；取离心后各浓度聚乙二醇6000系列对照品溶液和处理后的水相抗原的上清液200μl加至96孔平底酶标板中，每孔用多通道移液器迅速加入质量浓度为5%的氯化钡溶液50µl和浓度为0.1mol/l的碘溶液25µl，混匀，室温孵育15分钟；平底酶标板放入酶标仪，在535nm波长处读取各od值；

5、⑶根据10~90μg/ml系列聚乙二醇6000对照品液的浓度及其535nmod值，使用excel以535nmod值为x轴，以聚乙二醇6000对照品浓度为y轴，建立直线回归方程；

6、⑷将处理后的水相抗原的535nmod值代入直线回归方程计算，即得其聚乙二醇6000残留量，再按下式计算口蹄疫灭活疫苗中的聚乙二醇6000残留量：

7、 ；

8、式中：c为口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量；w为水相抗原聚乙二醇6000残留量；k为水相抗原的稀释倍数。

9、所述步骤⑴中水相抗原按下述方法制得：量取3ml口蹄疫灭活疫苗样品于10ml的一次性离心管中，加入正戊醇0.3ml(正戊醇：疫苗=1：10)，振摇混合4~5min，2~8℃静置半小时，待分层完全破乳后，用带平头针头的2ml一次性注射器吸取下层水相1.0~1.3ml于2ml一次性离心管，即得水相抗原。

10、所述步骤⑴中除脂按下述方法进行：在水相抗原中加入三氯乙烯300μl，用力振摇4min；4℃ 3000g离心15分钟，吸取离心管的上清液约1ml于一支新的2ml离心管；所述三氯乙烯与所述水相抗原的体积比为1：4。

11、所述步骤⑴中稀释按下述方法进行：预估水相抗原中聚乙二醇6000的残留量，当预估残留量不高于200μg/ml，则无需稀释；当预估残留量高于200μg/ml，则用去离子水稀释经除脂处理的水相抗原，使其聚乙二醇6000含量不高于200μg/ml。

12、所述步骤⑵中聚乙二醇6000系列对照品溶液按下述方法制得：首先精密称取0.0100g的聚乙二醇6000，加水溶解至100ml，即得100μg/ml聚乙二醇6000对照品母液；然后用去离子水、质量浓度为1%的牛血清蛋白溶液和100μg/ml聚乙二醇6000对照品母液按表1配制10~90μg/ml聚乙二醇6000系列对照品溶液；

13、表1 聚乙二醇6000系列对照品溶液配制表

14、。

15、质量浓度为1%的牛血清蛋白溶液是指精密称取0.10g牛血清蛋白，加去离子水溶解至10ml即得。

16、本发明与现有技术相比具有以下优点：

17、1、本发明使用多通道移液器，能够在几分钟内完成试剂添加。

18、2、本发明使整个反应过程在平底酶标板上进行，实现了平底酶标板加样、反应完成后在酶标仪上快速读数的目的。同时室温孵育时间统一，加入反应试剂和读数同时进行，降低了样品间加入试剂和孵育时间不统一带来的误差，使结果准确可靠。

19、3、本发明能够同时测定多个样品，提高了测定效率，降低了操作者的劳动强度。

20、4、本发明使用的对照品、样品和试剂量都是微量，因此所产生的实验室废液也是少，大大降低了实验室废液回收成本，有利于环境保护。

21、5、采用本发明方法后，能够快速、高效、准确地测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量，从而有效控制聚乙二醇6000残留量，提高口蹄疫灭活疫苗的稳定性，减少免疫时的副反应的发生，保证口蹄疫灭活疫苗质量。

技术特征：

1.一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法，其特征在于：所述步骤⑴中水相抗原按下述方法制得：量取3ml口蹄疫灭活疫苗样品于10ml的一次性离心管中，加入正戊醇0.3ml(正戊醇：疫苗=1：10)，振摇混合4~5min，2~8℃静置半小时，待分层完全破乳后，用带平头针头的2ml一次性注射器吸取下层水相1.0~1.3ml于2ml一次性离心管，即得水相抗原。

3.如权利要求1所述的一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法，其特征在于：所述步骤⑴中除脂按下述方法进行：在水相抗原中加入三氯乙烯300μl，用力振摇4min；4℃ 3000g离心15分钟，吸取离心管的上清液约1ml于一支新的2ml离心管；所述三氯乙烯与所述水相抗原的体积比为1：4。

4.如权利要求1所述的一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法，其特征在于：所述步骤⑴中稀释按下述方法进行：预估水相抗原中聚乙二醇6000的残留量，当预估残留量不高于200μg/ml，则无需稀释；当预估残留量高于200μg/ml，则用去离子水稀释经除脂处理的水相抗原，使其聚乙二醇6000含量不高于200μg/ml。

5.如权利要求1所述的一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法，其特征在于：所述步骤⑵中聚乙二醇6000系列对照品溶液按下述方法制得：首先精密称取0.0100g的聚乙二醇6000，加水溶解至100ml，即得100μg/ml聚乙二醇6000对照品母液；然后用去离子水、质量浓度为1%的牛血清蛋白溶液和100μg/ml聚乙二醇6000对照品母液按表1配制10~90μg/ml聚乙二醇6000系列对照品溶液；

6.如权利要求5所述的一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法，其特征在于：质量浓度为1%的牛血清蛋白溶液是指精密称取0.10g牛血清蛋白，加去离子水溶解至10ml即得。

技术总结本发明涉及一种微量法测定口蹄疫灭活疫苗聚乙二醇6000残留量的方法，该方法包括以下步骤：⑴采用正戊醇对口蹄疫灭活疫苗样品进行破乳，即得水相抗原；水相抗原用三氯乙烯和去离子水进行除脂和稀释处理后，即得处理后的水相抗原；⑵精密量取10μg/ml~90μg/ml聚乙二醇6000系列对照品溶液和处理后的水相抗原，加高氯酸溶液混匀，室温放置15分钟后离心；取离心后各浓度聚乙二醇6000系列对照品溶液和处理后的水相抗原的上清液加至96孔平底酶标板中，加氯化钡溶液和碘溶液混匀，室温孵育后放入酶标仪读取各OD值；⑶建立直线回归方程；⑷计算口蹄疫灭活疫苗中的聚乙二醇6000残留量。本发明快速、高效、准确。技术研发人员：马志鹏,王赛措,郭建荣,张昊,朱琳,杨晶晶,杨进才,王富强,张芳芳,李杨,刘洋,任芳瑶,黄立军,王静,蔺芳英,麻红霞,俞宗佑,刘元鹏,杨文龙,王妤欣受保护的技术使用者：中农威特生物科技股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/14