一种低湿条件下山梨酸钾诱导3D重组干眼模型的建立方法与流程

本发明属于组织工程，具体涉及一种低湿条件下山梨酸钾诱导3d重组干眼模型的建立方法。

背景技术：

1、混合型干眼是临床上最常见的干眼，为两种或两种以上病因导致的干眼。干眼症患病率逐年升高并对人的身心健康、工作生活及社会生产经济的发展有负面影响。泪膜不稳定、炎症和损伤是导致生理病理过程的主要机制。尽管干眼症发病普遍，但特效的治疗药物及治疗手段确很少，这与干眼的多样性和干眼模型的匮乏有关。

2、此外，干眼造模方式的选择对药物筛选有很大影响，不同造模方式引起的干眼病和严重程度迥异。目前，角膜上皮细胞是构建体外干眼角膜上皮细胞模型的种子细胞。但2d细胞培养无法完全模拟体内细胞的微环境，‌导致细胞形态、‌分化、‌细胞与基质间的相互作用以及细胞与细胞间的相互作用与体内生理条件下细胞的行为存在明显差异，导致实验结果与体内实际情况存在差异。干眼症动物模型是研究干眼的发病机制，探索治疗方法的常用模型。但干眼动物模型的建立手术复杂、方法操作难度大需要较高的技术条件和高超的手术技巧或较长的时间，角膜在离体之后活性降低，并且不可控因素过多，变异性较大。一方面不同动物模型的使用均具有一定的局限性，与临床实际情况有一定差距；另一方面手术会对动物产生较大的不可逆创伤，严重违反了3r原则的精神。尽管干眼动物模型模拟患者干眼的某些病理特征，但没有一种动物模型可准确重现人类干眼的全部症状和体征，特别是病理变化的多样性和疾病的慢性进展性特征。综上，2d细胞干眼模型、动物干眼模型均限制了在疾病建模、‌组织工程、‌药物筛选和个性化医疗等领域的应用。

3、山梨酸钾是一种抗菌防腐剂，在食品、饮品、护肤品、药业等行业不断的发展运用。山梨酸钾在大部分滴眼液中均有添加。部分眼药水有适当防腐剂是正常的，但长期频繁使用含有防腐剂的眼药水可能会进一步加剧干眼症，其可破坏角膜上皮细胞层的浅表面细胞间的紧密连接，引起泪膜稳定性破坏、眼表炎症、角膜上皮细胞凋亡与损伤等，甚至造成药源性干眼，其临床表现和相关组织病理改变均类似于人的干眼症。

4、许多研究发现干燥低湿度环境是导致泪液蒸发过快，泪膜破裂时间缩短，泪膜渗透压升高，眼表炎症因子表达上调的主要原因之一。现代医学认为干燥环境能使眼表泪液蒸发过快，从而导致干眼发生。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服2d细胞与动物模型在干眼疾病建模、‌药物筛选和个性化医疗等领域的局限性，建立了一种低湿条件下用山梨酸钾诱导的3d重组干眼替代模型方法，并且对此方法诱导的模型的稳定性进行研究，观察了低湿条件下局部使用山梨酸钾诱导的3d重组干眼症模型的稳定性，并确定了该模型的有效时间。该方法‌可以有效地模拟人类干眼症状，还可以通过炎症因子、组织活力、组织学结构直观表征干眼模型的状态。此外该方法诱导的干眼模型操作方法简单，模型诱导过程耗时短，成本相较低廉，获得的模型稳定性好，更容易实现体系化与标准化，同样此模型使用人角膜上皮细胞可以避免种属差异，在评价药物或治疗方法，深入研究干眼症的发病机制及潜在的治疗策略方面提供一个新视角。

2、本发明通过以下技术方案实现的：

3、（1）山梨酸钾诱导浓度筛选；

4、收集角膜上皮细胞，使用p3～p9代细胞，以0.5 x104个/孔～1 x 104个/孔的接种密度接种至96孔板，待细胞融合率达到70%～80%时更换含有相应浓度样品的培养基，24 h后用mtt工作液避光孵育3 h，最后每孔加100～200 μl异丙醇于酶标仪上读取570 nm吸光度。

5、（2）体外重组3d角膜上皮模型构建；

6、收集角膜上皮细胞，使用p3～p7代细胞，以100±50w/孔的接种密度接种至coating matrix包被过的transwell小室内，小室置于6孔板中培养，小室内外各加入相应体积的培养基ⅰ，以液面位于同一水平面为准；于培养第5天更换培养基ⅱ开始气液界面培养，全程共培养10-15天；

7、（3）低湿条件下采用模拟人体给药方式诱导体外重组3d干眼模型；

8、其中所述低湿培养的条件为30～40℃，5% co2，rh30～60%。

9、1）药品准备：0.05%～1%的山梨酸钾，阴性对照组给药15μl～50μlpbs，实验组给药15μl～50μl山梨酸钾；

10、2）模型准备：6孔板中添加0.9ml的培养基ⅱ，进行实验分组，每孔放置一个（2）获得的体外重组3d角膜上皮模型；

11、3）模型给药：在超净工作台中进行所有的给药操作，于气液培养第7天～第9天，开始模拟人体给药方式，用移液枪吸取药品，缓慢滴加于模型表面，间隔30 s~2 min给药一个模型，轻轻抖动模型确保药品均匀分布于模型表面。

12、4）诱导时间：每天给药1次，连续给药24h~48h。

13、5）干眼模型建模成功验证

14、①炎症因子检测：从1）～4）获得的干眼模型，每组中随机选择3个，给药组织的给药时间结束后，收集培养基于ep管中-80℃保存，用于炎症细胞因子tnf-α检测。应用graphpadprismprogram软件作图，各组间采用 t-test统计分析，* p＜0.05表示差异显著，** p＜0.01表示差异极显著。

15、②组织活力检测：取出模型开始洗涤程序。控制每个培养小室洗涤30s，用杜氏酸盐缓冲溶液洗模型15次，用无菌纱布或无菌棉棒擦拭。转移至含有300μlmtt工作液的24孔板中，避光孵育3 h，用移液器吸除mtt工作液，将干眼模型完全浸没至每孔含1.5ml异丙醇的24孔板，摇床震荡2h，得到异丙醇的浸提物，吸取200μl的到异丙醇浸提物到96孔板中于酶标仪上读取570 nm吸光度。应用 graphpadprismprogram软件作图，各组间采用 t-test统计分析，* p＜0.05表示差异显著，** p＜0.01表示差异极显著。

16、③组织学结构检测：4%多聚甲醛进行固定，送至第三方检测机构检测模型的组织学结构。与对照组ck比较，组织学结构各层排列仍欠规整，组织结构不紧密，有空泡出现等。

17、（4）体外重组3d干眼模型的有效性及稳定性验证；

18、①从（3）获得的干眼模型，每组中随机选择3个，给药组织的给药时间结束后，取出模型开始洗涤程序。控制每个培养小室洗涤30s，用杜氏酸盐缓冲溶液洗模型15次，用无菌纱布或无菌棉棒擦拭。

19、②清洗结束后，转移至含有0.9ml的培养基ⅱ的6孔板中，分别孵育0h、24h、48h。

20、③孵育结束后对得到的干眼模型进行相应检测工作，检测方法同上（检测组织学结构、炎症因子、组织活力）。

21、优选地，培养基ⅰ包含：基础成分为ksfm，添加成分为：1～10%胎牛血清、1～20μg/ml胰岛素、0.5～2%青霉素-链霉素、0.5～2%l-谷氨酰胺，所述百分比为体积百分比。

22、优选地，培养基ⅱ包含：基础成分为ksfm，添加成分为：0.1～5%牛脑垂体提取物、1～20μg/ml胰岛素、1～10ng/ml氢化可的松、0.5～10ng/ml表皮细胞生长因子、0 .5～10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1～10μg/ml转铁蛋白、0.5～2%青霉素-链霉素，所述百分比为体积百分比。

23、本发明的有益效果为：

24、（1）本发明建立了一种组织结构和生理功能与干眼症角膜组织十分相似的干眼替代模型。

25、（2）本发明首次使用山梨酸钾诱导损伤模型，观察了结合温湿度调控局部使用山梨酸钾诱导的3d重组干眼症模型的稳定性，并确定了该模型的有效时间。

26、（3）使用体外3d重组方法构建模型，替代动物模型与2d细胞模型，保障动物福利及弥补2d细胞的缺点，可以了避免种属差异，在评价药物或治疗方法，深入研究干眼症的发病机制及潜在的治疗策略方面提供一个新视角，满足市场上对稳定干眼模型的需求。

27、（4）山梨酸钾模拟人体表面给药易对眼表造成损伤，3d重组干眼模型建模时间较动物模型短，因此更适合用于短期内严重干眼症的模型建立。

28、（5）本发明控制培养箱内的温湿度，更能模拟干眼症在真实干燥低湿环境条件下，提高干眼实验模型的准确性。

29、（6）此方法诱导的干眼模型操作方法简单，模型诱导过程耗时短，成本相较低廉，获得的模型稳定性好，更容易实现体系化与标准化。

30、本发明经过大量实验，筛选出在40℃，5% co2，rh30～60%培养环境中，采用30μl0.5%山梨酸钾诱导24h可以获得干眼模型；给药并冲洗结束后，于含有0.9ml的培养基ⅱ的6孔板中孵育48h，体外重组的3d干眼模型仍保持其有效性，说明采用以上方法诱导的模型稳定性较好。获得的体外重组3d干眼模型炎症因子升高、组织活力降低、基质层细胞部分缺失且排列疏松，细胞层数减少，出现空泡等现象。基于此，综合考虑将以上条件确定为本发明的优选条件。