表达活性D-脯氨酸还原酶的微生物以及生产活性D-脯氨酸还原酶的方法与流程

本公开涉及表达d-脯氨酸还原酶的微生物——其中prda蛋白、prdb蛋白和prdh蛋白的活性增强；和生产相应的活性d-脯氨酸还原酶的方法。在此基础上，本公开还涉及还原d-脯氨酸和d-脯氨酸类似物的方法；和prdh蛋白，该prdh蛋白具有当与prda蛋白和prdb蛋白共表达时将非活性d-脯氨酸还原酶转化为活性d-脯氨酸还原酶的活性。

背景技术：

1、由于环境友好产品的发展趋势以及不稳定的供油和耗油危机，已经对生物质衍生产品比如生物塑料、生物能源等进行了研究和开发。特别地，正在进行许多研究以将各种生物质衍生的单体应用于尼龙。例如，正在研究通过应用生物质衍生的腐胺来开发尼龙4,6，以及通过应用生物质衍生的尸胺来开发尼龙5,6，以替代尼龙6,6的己二胺(hmda)。通过使用4-氨基丁酸(或γ-氨基丁酸(gaba))作为单体的尼龙4产品的开发也在进行中，该单体可以通过谷氨酸脱羧酶以谷氨酸为原料生产。

2、已知的是，作为尼龙5的单体的5-氨基戊酸通过d-脯氨酸还原酶由脯氨酸转化。然而，d-脯氨酸还原酶的活化需要prda蛋白的精确自切割并且同时引入丙酮酰基。然而，这被认为是技术限制，并且因而对能够制备活性d-脯氨酸还原酶的方法的需求日益增加。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明人继续研究可以生产活性形式的d-脯氨酸还原酶的重组表达系统和微生物菌株，并且还研究了其对各种d-脯氨酸类似物底物的适用性。结果，他们首次鉴定了prdh蛋白，该蛋白在与prda蛋白和prdb蛋白共表达时将非活性d-脯氨酸还原酶转化为活性d-脯氨酸还原酶。进一步地，他们成功地证明了表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物和由其生产的d-脯氨酸还原酶的活性。

3、技术方案

4、本公开的目的是提供表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物，其中prda蛋白、prdb蛋白和prdh蛋白的活性增强。

5、本公开的另一个目的是提供生产活性d-脯氨酸还原酶的方法，该方法包括以下步骤：在培养基中培养微生物，以及从微生物或培养基中回收活性d-脯氨酸还原酶。

6、本公开的仍另一个目的是提供使用微生物或由微生物生产的活性d-脯氨酸还原酶生产选自氨基戊酸(5-氨基戊酸，5-ava)、γ-氨基丁酸(gaba)和5-氨基-4-羟基戊酸的一种或多种的方法。

7、本公开的仍另一个目的是提供prdh蛋白，该prdh蛋白在与prda蛋白和prdb蛋白共表达时将非活性d-脯氨酸还原酶转化为活性d-脯氨酸还原酶。

8、本公开的仍另一个目的是提供生产表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物的方法，该方法包括以下步骤：用包括prda基因或prda和prdh基因的表达盒转化宿主细胞，和用包括prdb基因或prdb和prdh基因的表达盒转化宿主细胞。

9、有益效果

10、在本公开中，新提出了能够将非活性d-脯氨酸还原酶转化为活性d-脯氨酸还原酶的多肽，并且当通过与构成现有d-脯氨酸还原酶的prda和prdb的复合物相互作用而表达时或者当与prd操纵子一起表达时，增强了活性d-脯氨酸还原酶的活性，从而提供了d-脯氨酸还原酶的新型活性形式和转化d-脯氨酸或其类似物的方法。

技术特征：

1.一种生产表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的生产表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述prda蛋白包括seq id no：3或seq id no：19的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的生产表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述prdb蛋白包括seq id no：5或seq id no：21的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的生产表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述prdh蛋白包括seq id no：1或seq id no：23的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的生产表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中另外增强了选自prdd、prde和prde2的一种或多种蛋白的活性。

6.根据权利要求1所述的生产表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中另外增强了选自prdc、prdg和prdf的一种或多种蛋白的活性。

7.根据权利要求1所述的生产表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述微生物是埃希氏杆菌属的微生物。

8.根据权利要求7所述的生产表达活性d-脯氨酸还原酶的微生物的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。

9.一种生产选自氨基戊酸(5-氨基戊酸，5-ava)、γ-氨基丁酸(gaba)和5-氨基-4-羟基戊酸中的一种或多种的方法，所述方法包括：

技术总结本发明的名称是表达活性D‑脯氨酸还原酶的微生物以及生产活性D‑脯氨酸还原酶的方法。本公开涉及表达活性D‑脯氨酸还原酶的微生物。技术研发人员：朴陈承,朴普晟,梁荣烈,吴麟锡,李那鸿,文准玉受保护的技术使用者：CJ第一制糖株式会社技术研发日：技术公布日：2024/11/14