一种分子工具载体表达系统及其应用

本申请涉及生物，尤其涉及一种分子工具载体表达系统及其应用。

背景技术：

1、非编码rna(ncrna)是一种从dna转录但不翻译成蛋白质的rna分子，其主要包括micro rna(mirna)、转移rna(trna)、长链非编码rna(lncrna)、环状rna(circrna)、小核rna(snrna)、小核仁rna(snorna)和piwi相互作用rna(pirna)等。其中小核仁rna(snornas)是一类中等长度的非编码小rna，其长度一般在60nt～300nt这一范围内，并且snornas主要通过短碱基配对区域来引导靶rna中核苷酸的位点特异性修饰；snornas广泛存在于真核细胞的核仁中，并且在rrna的修饰中发挥着重要作用。现阶段的研究表明snorna也会参与trna和mrna的修饰，此外现阶段研究表明许多snornas不仅在肿瘤中失调，而且其表达水平与临床预后有关，这些研究中以内皮特异性snorna过表达的研究最为突出。目前用于过表达snorna的载体主要流程是：先从细胞直接pcr扩增成熟的snorna序列，并将其构建到含u6或者cmv启动子的载体上，最后使用此病毒感染人脐静脉内皮细胞，以实现内皮特异性高表达snorna。

2、然而目前内皮特异性snorna过表达的相关研究存在以下难点:首先常见的高表达载体的启动子都是u6启动子或是cmv启动子，这些启动子很难准确的在某类器官内高表达出snorna，只能在全身广泛性的表达snorna，这导致实际表达效果与预期的不符；其次由于snorna主要由蛋白质编码基因和非蛋白质编码基因的内含子区编码，经基因剪切过程中释放内含子则需要经进一步加工形成成熟的snorna，因此基于上述两点，现阶段稳定过表达snorna存在精确差且效率低的问题。

技术实现思路

1、本申请提供了一种分子工具载体表达系统及其应用，以解决如下技术问题：如何实现精确且高效地稳定过表达snorna。

2、第一方面，本申请提供了一种分子工具载体表达系统，所述分子工具载体表达系统包括内皮特异性基因启动子序列以及表达snorna的骨架序列，其中，所述内皮特异性基因启动子序列来源于icam2基因，所述骨架序列来源于rpl13a基因中snord32a的2号内含子区域。

3、可选的，所述内皮特异性基因启动子序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、可选的，所述骨架序列依次包括2号内含子区域的上游序列、2号内含子区域以及2号内含子区域的下游序列，所述上游序列为所述2号内含子区域的3’端上游的预设长度的序列，所述下游序列为snord32a中到所述2号内含子区域的5’端下游的所述预设长度的序列。

5、可选的，所述预设长度为30bp。

6、可选的，所述上游序列的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述2号内含子区域的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述下游序列的核苷酸序列如seq id no.4所示。

7、可选的，所述骨架序列的核苷酸序列如seq id no.5所示。

8、第二方面，本申请提供了一种分子工具载体，所述分子工具载体具有第一方面所述的分子工具载体表达系统。

9、可选的，所述工具载体包括以下至少一种：

10、真核表达载体、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。

11、第三方面，本申请提供了一种制备第二方面所述的分子工具载体的方法，所述方法包括：

12、以huvec细胞基因组为模板并使用第一扩增引物组进行pcr扩增，后进行纯化，以得到icam2片段；

13、将所述icam2片段与具有cmv启动子的腺相关病毒载体进行第一双酶切，后进行纯化和t4连接酶连接，以得到第一重组质粒；

14、以鼠bc16细胞基因组为模板并使用第二扩增引物组进行pcr扩增，后进行纯化，以得到过表达snorna的dna序列；

15、将过表达snorna的所述dna序列与所述第一重组质粒进行第二双酶切，后进行纯化和t4连接酶连接，以得到第二重组质粒；

16、使用同源重组技术分别将snord15a、snord118和dsred序列插入到所述第二重组质粒，后进行测序筛选，以得到分子工具载体；

17、其中，所述第一扩增引物组具有第一酶切位点组，所述第一酶切位点组与所述第一双酶切的酶切位点相同；

18、所述第二扩增引物组具有第二酶切位点组，所述第二酶切位点组与所述第二双酶切的酶切位点相同；

19、所述第一酶切位点组和所述第二酶切位点组不同。

20、可选的，所述第一酶切位点组包括avrii位点和bspei位点；所述第二酶切位点组包括ecorⅰ位点和eagⅰ位点。

21、本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

22、本申请实施例提供的一种分子工具载体表达系统，所述分子工具载体表达系统包括内皮特异性基因启动子序列以及表达snorna的骨架序列，其中，所述内皮特异性基因启动子序列来源于icam2基因，所述骨架序列来源于rpl13a基因中snord32a的2号内含子区域；相比传统的过表达snorna的分子工具载体，使用来源于icam2基因的内皮特异性启动子替代传统的u6或者cmv启动子，可以特异性的启动snorna的表达，另外设计来源于rpl13a基因中snord32a的2号内含子区域的骨架序列，由于该2号内含子区域的两侧存在天然的剪接位点序列，可以促使骨架序列存在多个剪接位点，可以在不引入额外核酸碱基序列的前提下，表达阶段的相关酶能够对snorna序列进行精准剪接的同时还能促使骨架序列高效地表达snorna，从而可以实现精确且高效地稳定过表达snorna。

技术特征：

1.一种分子工具载体表达系统，其特征在于，所述分子工具载体表达系统包括内皮特异性基因启动子序列以及表达snorna的骨架序列，其中，所述内皮特异性基因启动子序列来源于icam2基因，所述骨架序列来源于rpl13a基因中snord32a的2号内含子区域。

2.根据权利要求1所述的分子工具载体表达系统，其特征在于，所述内皮特异性基因启动子序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的分子工具载体表达系统，其特征在于，所述骨架序列依次包括2号内含子区域的上游序列、2号内含子区域以及2号内含子区域的下游序列，所述上游序列为所述2号内含子区域的3’端上游的预设长度的序列，所述下游序列为snord32a中到所述2号内含子区域的5’端下游的所述预设长度的序列。

4.根据权利要求3所述的分子工具载体表达系统，其特征在于，所述预设长度为30bp。

5.根据权利要求4所述的分子工具载体表达系统，其特征在于，所述上游序列的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述2号内含子区域的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述下游序列的核苷酸序列如seq id no.4所示。

6.根据权利要求1所述的分子工具载体表达系统，其特征在于，所述骨架序列的核苷酸序列如seq id no.5所示。

7.一种分子工具载体，其特征在于，所述分子工具载体具有权利要求1～6任一项所述的分子工具载体表达系统。

8.根据权利要求7所述的分子工具载体，其特征在于，所述工具载体包括以下至少一种：

9.一种制备如权利要求7或8所述的分子工具载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一酶切位点组包括avrii位点和bspei位点；所述第二酶切位点组包括ecorⅰ位点和eagⅰ位点。

技术总结本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种分子工具载体表达系统及其应用；所述分子工具载体表达系统包括内皮特异性基因启动子序列以及表达snoRNA的骨架序列，其中，所述内皮特异性基因启动子序列来源于ICAM2基因，所述骨架序列来源于rpl13a基因中SNORD32A的2号内含子区域；使用来源于ICAM2基因的内皮特异性启动子替代传统的U6或者CMV启动子，可以特异性的启动snoRNA的表达，另外设计来源于rpl13a基因中SNORD32A的2号内含子区域的骨架序列，可以促使骨架序列存在多个剪接位点，从而可以实现精确且高效地稳定过表达snoRNA。技术研发人员：张春祥,付敏,王昳,冯建国,余亚军,余烊,李胜彪,袁琼,王晓斌,万英受保护的技术使用者：西南医科大学附属医院技术研发日：技术公布日：2024/11/4