基于InDel的鉴定大白菜与芝麻菜属间杂交的方法及引物对

本技术涉及远缘新种质的鉴定，具体涉及基于indel技术鉴定大白菜与芝麻菜属间杂交的异源四倍体的试剂盒开发。

背景技术：

1、随着人口的不断增长和经济的快速发展，农业生产的需求也日益多样化。这些需求例如包括更好的味道、更高的产量、更优的抗病、抗虫害、抗胁迫能力等。为了满足不断增长的需求，培育杂交新种质成为了农业领域中一项至关重要的技术。如何精确鉴定杂交后代真实性是创制之后面临的又一重要问题。

2、大白菜和芝麻菜是常见的农作物，具有重要的经济价值。对于大白菜和芝麻菜远缘杂交种的鉴定，通常采用的是形态学和细胞学鉴定，形态学鉴定具有操作简单等优点，但是易受环境和人为因素影响，鉴定结果不够可靠。虽然亦有利用分子标记进行鉴定，但其设计较难且有时需要两对或更多对引物来鉴定，操作相对复杂。

3、indel是指一个序列上某一位点相比于同源序列增加或减少了一个或多个核苷酸。目前，indel分子标记应用于远缘杂交后代真实性鉴定的研究的报道较少，尤其是十字花科蔬菜的远缘杂交后代真实性鉴定。在果树领域，韩健等(沙田柚×枳杂交群体创建与indel标记鉴定,果树学报,2023,40(02):223-229)以沙田柚为母本，枳为父本进行属间杂交，通过indel标记鉴定出杂种苗，然而在所设计的多对indel引物中，有的无法区分枳和柚，有的无法扩增出柚特异性条带，仅一对indel引物可对杂交后代群体进行鉴定。

4、因此，在远缘杂交新种质领域，存在提供能够方便、准确鉴定新种质的强烈需求。

技术实现思路

1、有鉴于此，在第一方面，本发明提供了一种基于indel技术的鉴定大白菜与芝麻菜属间杂交的异源四倍体的方法，包括：

2、获取待鉴定的样本，所述样本是以大白菜‘72049’为母本，芝麻菜‘astro’为父本进行属间杂交，经胚挽救和染色体加倍后获得的材料；

3、以所述材料的基因组dna为模板，利用以下indel引物对进行扩增：

4、正向引物5’-3’：gctgacagaatcaaaagcagct，

5、反向引物5’-3’：gcacaaggacactgtccagc；

6、对扩增后的产物进行凝胶电泳；以及

7、观察电泳条带确定异源四倍体的真实性。

8、在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括利用所述indel引物对对母本和父本进行扩增。

9、在一些实施方式中，观察条带包括当样本同时出现母本和父本的条带，则证实获得了异源四倍体。

10、在具体的实施方式中，所述扩增条件包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30-40个循环。

11、在具体的实施方式中，所述indel引物对的扩增对象位于大白菜杂交种的a05染色体上，具体位于braa05g042250.3.5c基因的外显子上。

12、详细信息如下：

13、 chr start end ref alt location gene a05 27756034 27756036 ttg - exonic braa05g042250.3.5c

14、aaagcaacaacatctcctcacgagtggcgagcgcaatgtccatggaacgatggtgttcaaggcagtacattattttcttctgtaccagattatttaactcactcactgcattcagatcaccttccgagaaagttcctagagctgccctagcttgagcacgggctgttttcggaccttggtgaatattgttttcaaacaactcggacaagataccagctgcaacaagttgtttcctagatcttggatgcttcgacagcatttgaagaatctcgagacattgagtgacaaatgtagtggcacaaccgtaacaattgtttggggtctttgaaaccacacatcttgaagcaccagatgaaaagttcgaatttttctgatggaggtaattcatcagaactctgcgaagtccctgcagtgtttgtacacttttgctgacagaatcaaaagcagctttgcacttctcaccatacagtacacccaaaagtgcgactttgcggtttatcttgttgcatgagggaccaggcaaagatgccatcatttgctggacagtgtccttgtgctgtgaatccatttcagtttcaccaatgcttgatacaatcttcagaagcggcttcttgaagcctaagagttgctgatatctcctgtgagcgttttcagactcggactctatagcagccaatcccctcttcatatcttcgtcattttccatattatcaaatatgaagctcggttttgccatgaagttgaactcaaacctcccatacttgctataaccacactcgttgcacaggaaagaatccaaattttcgtagttgatgttgcggcattgcctgcactgataagcattctcatgacagttgctgcagataccatgcttatcagtaaccggtcgactgcatcgagggcattgcaatggttcaagagataacgcctgaagattctcatagaaggaatccaactcgatcatgaagttacaagccgtaatgggaatgggaaactccacctt

15、在优选的实施方式中，所述获取的步骤包括：以大白菜‘72049’为母本，芝麻菜自交系‘astro’为父本，蕾期杂交授粉，取授粉后7天后子房，无菌条件下进行胚拯救，并进行加倍处理。示例性的，蕾期采用浓度为62.3mg/l的mgcl2.6h2o溶液喷施柱头，15-20分钟后，采用涂抹的方式进行杂交授粉。

16、在第二方面，本发明提供了一种用于鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体indel引物对，所述引物对由正向引物5’-3’：gctgacagaatcaaaagcagct，和反向引物5’-3’：gcacaaggacactgtccagc组成。

17、在第三方面，本发明提供了一种鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所定义的indel引物对。

18、在一些实施方式中，本发明的试剂盒进一步包括大白菜‘72049’的基因组dna和芝麻菜‘astro’基因组dna。

19、在第四方面，本发明提供了第二方面所定义的indel引物对用于鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体的用途。

20、在第五方面，本发明提供了第三方面所定义的试剂盒用于鉴定母本大白菜‘72049’与父本芝麻菜‘astro’属间杂交的异源四倍体的用途。

21、在获得‘大白菜72049×芝麻菜astro’中间材料后，如何准确、便捷地对杂交种进行鉴定是面临的又一难题，发明人克服了传统形态学鉴定易受环境和人为因素影响且鉴定结果不够可靠的缺陷；同时克服了indel分子标记进行远缘杂交种的鉴定的研究较少以及设计难度大的现状，成功筛选出用于鉴定引物对，该引物对用于鉴定大白菜72049×芝麻菜astro的异源四倍体时操作简便且结果准确。