一种基于生物正交点击化学的生物墨水材料及其制备方法与流程

本发明属于生物3d打印，尤其涉及一种基于生物正交点击化学的生物墨水材料及其制备方法。

背景技术：

1、生物墨水材料主要是由天然材料或者人工高分子材料组成，具有良好的生物相容性，能够装载细胞、生长因子、药物等。其中天然材料如明胶、胶原、透明质酸钠、海藻酸钠、壳聚糖和羧甲基纤维素等；人工合成材料如聚乙二醇、聚乙烯醇、环氧乙烷、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、丙烯酸和丙烯酰胺等。

2、生物墨水材料可以通过一些方法固化形成，如生物正交点击化学法、光交联法、热交联法、酶促反应交联和离子交联法等。生物墨水材料需要能够模拟人体环境。在生物3d打印中，通常使用生物墨水材料来装载细胞支持细胞生长，增大细胞分化与增殖所需营养的接触途径。

3、自2000年以来，通过生物正交点击化学合成的材料已成为一类独特的生物材料，广泛应用于各种生物医学研究。相比与其他交联法，正交点击化学反应更温和，更具有细胞相容性，并且产生的网络结构缺陷更少。利用生物正交点击化学反应能显著改善材料的机械性能。点击化学活性基团的选择性反应(例如，降冰片烯-四嗪，降冰片烯-反环辛烯，叠氮化物-炔，叠氮化物-环辛，硫醇-降冰片烯，硫醇-马来酰亚胺等)不仅有利于材料交联，而且还允许通过二次反应对材料的物理化学性质进行特定的剪裁。

4、生物正交点击化学是通过将相互反应的点击试剂偶联到多功能高分子材料，然后将修饰过的高分子材料简单混合进行反应。通过调节高分子材料的浓度、分子量和化学计量比，可以制备具有不同网络结构或交联密度的材料。这些特征影响了材料的机械性能，从而调控细胞命运。可见，生物正交点击化学适用于可打印生物墨水材料的修饰。

5、组织或器官移植的病变和缺陷仍然是临床医学亟待解决的问题，目前的方法包括自体移植、异种移植和人工机械器官的植入，但仍然存在问题。

6、自体移植虽能取得满意的效果，但其阳性结果是以损害机体的健康为代价的，并可能导致许多并发症和继发性损伤。异种移植也存在潜在的风险，如免疫排斥和病毒传播；此外，来源捐助者是有限的。在临床治疗中，人工器官的植入成功率较高，并提高了患者的生活质量。生物3d打印技术有望通过结合人体仿生组织或器官的构建来解决使用传统方法治疗时遇到的问题。

7、因此，本发明的目的在于提供一种基于生物正交点击化学的生物墨水材料及其制备方法，并基于此生物墨水材料构建生物3d打印人工器官。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题：现有的生物墨水材料打印过程中存在化学反应，例如基于gelma和hama生物3d打印过程中光引发的自由基聚合反应；再例如在支撑浴中加入交联剂，打印后交联剂扩散进入打印体中交联打印体。此外，现有的生物墨水材料粘弹性、延展性以及压缩性较差，在悬浮打印过程中打印精度不高，打印速度较慢的问题。

2、鉴于现有技术中存在的技术问题，本发明设计了涉及一种基于生物正交点击化学的生物墨水及其制备方法。本发明的生物墨水材料在生物3d打印过程中不发生化学反应，具备优异的生物相容性。

3、本发明采用了以下方案：

4、一种基于生物正交点击化学的生物墨水材料，其特征在于，按照质量份计算，包括如下组分：

5、天然大分子四嗪 2-20份；

6、四臂聚乙二醇降冰片烯 2-40份；

7、溶剂 40-96份；

8、其中，所述的天然大分子四嗪来自明胶、透明质酸及或胶原蛋白；

9、所述的溶剂为pbs缓冲溶液。

10、进一步地，所述的天然大分子四嗪为明胶四嗪、透明质酸四嗪或胶原蛋白四嗪。

11、进一步地，所述的明胶四嗪(gel-tz)的制备方法具体包括如下步骤：

12、步骤1：在30-60℃下，将明胶溶于缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到明胶溶液，用ph调节剂调节明胶溶液的ph至碱性；

13、步骤2：称取甲基四嗪活性酯(tz)后溶于dmso溶液，待其完全溶解后逐滴加入步骤1制备的明胶溶液中，在30-60℃下，搅拌反应6-24小时，得到混合溶液a；

14、步骤3：向混合溶液a加入纯水终止反应，然后将加入纯水后的混合溶液a进行透析、冻干即得到明胶四嗪(gel-tz)，冰箱中保存备用。

15、进一步地，所述的透明质酸四嗪(ha-tz)的制备方法具体包括如下步骤：

16、步骤i：在室温、搅拌的条件下，将透明质酸钠溶于缓冲溶液中，使其完全溶解得到透明质酸钠溶液，缓冲溶液的ph呈弱酸性；

17、步骤ii：分别称取n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)，在搅拌的条件下加入步骤i制备的透明质酸钠溶液，持续搅拌进行活化反应，得到活化后的透明质酸钠；

18、步骤iii：称取甲基四嗪胺，溶于dmso溶液,逐滴加入步骤ii中得到的活化后的透明质酸钠溶液中，搅拌反应12-48小时，得到混合溶液b；

19、步骤iv：反应结束后向混合溶液b中加入纯水终止反应，将加入纯水后的混合溶液b进行透析、冻干即得到透明质酸四嗪(ha-tz)，冰箱中保存备用。

20、进一步地，所述的胶原蛋白四嗪(col-tz)的制备方法具体包括如下步骤：

21、步骤i：在常温、搅拌的条件下，将胶原蛋白溶于缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到胶原蛋白溶液，用ph调节剂调节胶原蛋白溶液的ph至碱性；

22、步骤ii：称取甲基四嗪活性酯(tz)后溶于dmso溶液，待其完全溶解后逐滴加入步骤i制备的胶原蛋白溶液中，在常温下，搅拌反应4-24小时，得到混合溶液c；

23、步骤iii：向混合溶液c加入纯水终止反应，然后将加入纯水后的混合溶液c进行透析、冻干即得到胶原蛋白四嗪(col-tz)，冰箱中保存备用。

24、进一步地，所述的四臂聚乙二醇降冰片烯的制备方法具体包括如下步骤：

25、步骤①：在室温、搅拌的条件下，将四臂聚乙二醇氨基溶于缓冲溶液中，使其完全溶解得到四臂聚乙二醇氨基溶液，ph调节剂调节四臂聚乙二醇氨基溶液的ph至碱性；

26、步骤②：称取降冰片烯二酸酐(nb)加入步骤①制备的四臂聚乙二醇氨基溶液中，发生酰氧基与氨基之间的亲核取代反应，反应过程中保持反应液的ph值不变，反应6-24小时，得到混合溶液d；

27、步骤③：反应结束后，向混合溶液d加入纯水终止反应，将加入纯水后的混合溶液d进行透析、冻干即得到白色海绵状四臂聚乙二醇降冰片烯(peg-nb)。

28、进一步地，在所述的明胶四嗪(gel-tz)的制备方法中：

29、步骤1中所述的明胶溶液的浓度为0.1wt％-2.0wt％；

30、步骤2中所述的甲基四嗪活性酯(tz)与明胶溶液中的氨基摩尔比为(0.5-2)：1；所述的溶解甲基四嗪活性酯(tz)的dmso溶液占混合溶液a体积的4％-20％；

31、步骤1和步骤2中所使用的ph调节剂为氢氧化钠溶液，浓度为1-10mm；

32、所述的透明质酸四嗪(ha-tz)的制备方法中：

33、步骤i中所述的透明质酸钠溶液的浓度为0.1wt％-2.0wt％；

34、步骤ii中所述的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)和透明质酸钠羧基摩尔比为(1.5-10)：(1.5-10)：1，活化羧基时间为30-60分钟；

35、步骤iii中所述甲基四嗪胺(tz)与透明质酸钠羧基摩尔比为(0.5-2)：1；

36、步骤iii中所述用于溶解甲基四嗪胺(tz)的dmso溶液占混合溶液b体积的4％-20％。

37、进一步地，所述的四臂聚乙二醇降冰片烯的制备方法中：

38、步骤①中所述的四臂聚乙二醇氨基溶液的浓度为0.1wt％-10.0wt％；

39、步骤②中所述的降冰片烯二酸酐(nb)与四臂聚乙二醇氨基摩尔比为(0.5-20)：1；

40、步骤①、步骤②中所选的ph调节剂为氢氧化钠溶液，浓度为1-10mm。

41、本发明还公开了一种基于生物正交点击化学的生物墨水材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

42、步骤一：称取天然大分子四嗪溶于缓冲液中制备天然大分子四嗪缓冲溶液a；

43、步骤二：称取四臂聚乙二醇降冰片烯溶于缓冲溶液中制备四臂聚乙二醇降冰片烯缓冲溶液b；

44、步骤三：将天然大分子四嗪缓冲溶液a和四臂聚乙二醇降冰片烯缓冲溶液b混合均匀，25-40℃下静止2-6小时，即形成基于生物正交点击化学的生物墨水材料；

45、所述的天然大分子四嗪为明胶四嗪、透明质酸四嗪或胶原蛋白四嗪；

46、所述步骤一中，天然大分子四嗪中活性基团四嗪的摩尔数根据核磁氢谱或紫外可见吸收光谱进行定量；

47、当步骤一中天然大分子四嗪为明胶四嗪时，缓冲溶液a的质量浓度为10.0wt％-20.0wt％；

48、当步骤一中天然大分子四嗪为透明质酸四嗪时，缓冲溶液a的质量浓度为2.0wt％-4.0wt％；

49、当步骤一中天然大分子四嗪为胶原蛋白四嗪时，缓冲溶液a的质量浓度为10.0wt％-20.0wt％；

50、所述步骤二中，四臂聚乙二醇降冰片烯中活性基团降冰片烯的摩尔数根据核磁氢谱定量；

51、所述步骤二中，四臂聚乙二醇降冰片烯缓冲溶液b的质量浓度为2.0wt％-40.0wt％；

52、所述步骤三中，天然大分子四嗪缓冲溶液a和四臂聚乙二醇降冰片烯缓冲溶液b的混合比例是按照天然大分子四嗪中活性基团四嗪和四臂聚乙二醇降冰片烯中活性基团降冰片烯的摩尔数比为1：1进行混合。

53、本发明还公开了一种基于生物正交点击化学的生物墨水材料在生物3d打印中的应用。

54、在本发明关于明胶四嗪(gel-tz)的制备方法中，步骤1中所述的明胶溶液的浓度还可以进一步优选为1wt％；步骤2中所述的甲基四嗪活性酯(tz)与明胶溶液中的氨基摩尔比可以进一步优选为1：1；步骤2中反应时间为可以进一步优选为12小时；步骤二中混合液ph为9.0。

55、在本发明中，通过本发明的方法制备的到的透明质酸四嗪(ha-tz)为粉色海绵状。

56、在本发明关于透明质酸四嗪(ha-tz)的制备方法中，所述的透明质酸钠溶液的浓度可以进一步优选为1wt％；缓冲液可以进一步优选为ph值6.5的mes。

57、步骤ii中n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)和透明质酸钠羧基摩尔比可以进一步优选为5：5：1。步骤ii中n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)活化透明质酸钠羧基时间可以进一步优选为50分钟。步骤iii中甲基四嗪活性酯(tz)与透明质酸钠羧基摩尔比可以进一步优选为1：1；步骤ii中反应时间为可以进一步优选为24小时。

58、在本发明关于四臂聚乙二醇降冰片烯的制备方法中，步骤①中所述的四臂聚乙二醇氨基溶液的浓度可以进一步优选为1wt％；步骤②中反应时间可以进一步优选为12小时；步骤②中所述的降冰片烯二酸酐(nb)与四臂聚乙二醇氨基中氨基可以进一步优选为1：1。

59、在本发明中，可通过改变反应时间或活性基团与明胶上氨基的摩尔比来获得不同接枝率明胶四嗪。

60、在本发明中，可通过改变反应时间、活化剂与透明质酸钠羧基摩尔比或四嗪氨基与透明质酸钠上羧基的摩尔比来获得不同接枝率透明质酸四嗪。

61、在本发明中，可通过改变反应时间或活性基团与胶原蛋白上氨基的摩尔比来获得不同接枝率胶原蛋白四嗪。

62、在本发明中，可通过改变反应时间或活性基团与四臂聚乙二醇氨中氨基摩尔比来获得不同接枝率四臂聚乙二醇降冰片烯。

63、在本发明中，关于明胶四嗪、透明质酸四嗪、胶原蛋白四嗪和四臂聚乙二醇降冰片烯的反应机理，具体如图1-图4所示。

64、需要注意的是，在本发明中，除非另有规定，涉及组成限定和描述的“包括”的具体含义，既包含了开放式的“包括”、“包含”等及其类似含义，也包含了封闭式的“由…组成”等及其类似含义。

65、本发明提供了一种基于生物正交点击化学的生物墨水材料及其制备方法具有如下有益效果：

66、(1)本发明的生物正交点击化学的生物墨水材料不需要添加光引发剂，具有较高的粘弹性、延展性以及优异的压缩性能，在悬浮打印过程中能够带来更高的打印精度，实现更快的打印速度。

67、(2)本发明的生物正交点击化学的生物墨水材料的制备方法相比于离子交联、光交联，生物正交点击化学反应更温和，生物相容性更好，并且产生的水凝胶网络结构缺陷更少。

68、(3)本发明的生物正交点击化学的生物墨水材料的制备方法能显著改善水凝胶的机械性能。

69、(4)本发明的本发明的生物正交点击化学的生物墨水材料的制备方法具有良好的打印性和良好的自愈性能。