一种添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法

本发明涉及生物工程发酵，尤其涉及一种添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法。

背景技术：

1、胶原蛋白是哺乳动物体内最丰富的蛋白质，存在于皮肤、软骨、肌腱等中，占体内所有蛋白的30％。在分子结构上，每条胶原肽链主要由gly-x-y(x、y是gly之外的任何氨基酸残基)三联体重复构成，这种独特的结构是形成胶原纤维高级结构所必需的，它决定了胶原蛋白优良的生物相容性和低免疫原性，已广泛应用于医药、保健品及化妆品行业中。此外，胶原蛋白可以降低甘油三酯和胆固醇，对自发性高血压有一定的缓解作用，同时增加脂肪的分解并延长其过程，具有减肥、降血压和降血脂的作用。

2、胶原蛋白最初是从动物组织中提取的，该方法提取方法简单、成本低，但是获取的胶原蛋白水溶性差难以分离得到纯品，并且容易携带致病原。这种有限的生产在一定程度上限制了产品的应用和开发，很难满足日益增长的工业需求。如今胶原蛋白的提取技术在不断创新，而且由不同的表达系统(原核生物、酵母、植物、昆虫、哺乳动物和人类细胞等)产生的重组胶原蛋白也在不断创新。现阶段表达系统中以大肠杆菌和酵母为主，大肠杆菌属于原核表达系统，操作简单，发酵周期短，但无法对重组蛋白进行翻译后修饰，而且会有致病性等安全性问题。酵母表达因其成本较低、易高细胞密度发酵、不产生内毒素而简化了纯化及灭菌过程等受到研究者的关注。酵母作为真核生物，可对分泌重组蛋白进行修饰。近年来，为了解决蛋白质表达问题，科研工作者开始使用多形汉逊酵母和毕赤酵母。其中，毕赤酵母可以生产出与哺乳动物细胞糖基化高度相似的重组蛋白，具有非常强的转录调控系统，且毕赤酵母自身分泌的蛋白量少，有利于异源蛋白的高效表达及分离纯化，已成为最受欢迎的宿主细胞。

3、虽然目前已经有众多重组蛋白在毕赤酵母中成功高效表达，但是关于重组胶原蛋白在毕赤酵母中的表达量有待提高。其中影响目的蛋白产量的最主要因素就是其自身特性和具体的发酵工艺和发酵参数等。因此需要通过调整培养基的成分、培养条件、添加外源添加物等发酵工艺提高外源蛋白的表达量及其稳定性，从而提高重组胶原蛋白的分泌表达量。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法，采用该方法能进一步提高重组胶原蛋白产量。

2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、一种添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法，通过在毕赤酵母的摇瓶发酵或发酵罐发酵诱导阶段添加乙醇，提高重组胶原蛋白产量。

4、作为本发明的优选方式之一，所述乙醇的添加量为0.2％～1.6％(v/v)。

5、作为本发明的优选方式之一，所述乙醇的添加时间为毕赤酵母发酵诱导初期。

6、作为本发明的优选方式之一，当毕赤酵母采用摇瓶发酵方式时，乙醇的添加方式为：一次性补加至诱导培养基中；

7、当毕赤酵母采用发酵罐发酵方式时，乙醇的添加方式为：以0.5ml/h/l的流速流加至发酵液中。

8、作为本发明的优选方式之一，所述毕赤酵母的发酵罐发酵具体指5l发酵罐高密度发酵，发酵过程中：毕赤酵母菌液接种量为10％；生长阶段发酵温度为30℃，甲醇诱导阶段为28℃，ph为5；甘油补料及甲醇补料阶段关联溶氧，设置溶氧大于20％，转速设置为400～800rpm；在进入甲醇补料阶段的同时，控制蠕动泵，以0.5ml/h/l的流速流加终浓度为0.2％～1.6％(v/v)的乙醇。

9、作为本发明的优选方式之一，所述毕赤酵母为毕赤酵母基因工程菌；所述工程菌发酵表达的重组胶原蛋白为重组人源ii型胶原蛋白，核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。

10、关于上述毕赤酵母基因工程菌，需要说明的是，其为本发明实验室前期已成功构建的可以通过发酵表达重组胶原蛋白的毕赤酵母基因工程菌。在采用常规方法培养时，该工程菌在摇瓶水平诱导表达96h后的蛋白表达量约为0.45g/l；在5l发酵罐中，甲醇流加诱导表达72h左右，蛋白表达量达到最高，约为0.785g/l；但在诱导表达后期，蛋白会出现降解，造成蛋白产量较低。

11、本发明相比现有技术的优点在于：本发明通过在毕赤酵母基因工程菌的摇瓶水平和发酵罐高密度发酵诱导阶段初期添加乙醇，可以促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白，最终蛋白产量提高35％以上；本发明在过往报道中未曾提及，但作用效果明显；在工业生产中，乙醇相对于其他碳源更廉价，流加操作简单高效，适合大规模发酵生产。

技术特征：

1.一种添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法，其特征在于，通过在毕赤酵母的摇瓶发酵或发酵罐发酵诱导阶段添加乙醇，提高重组胶原蛋白产量。

2.根据权利要求1所述的添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法，其特征在于，所述乙醇的添加量为0.2％～1.6％。

3.根据权利要求1所述的添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法，其特征在于，所述乙醇的添加时间为毕赤酵母发酵诱导初期。

4.根据权利要求1所述的添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法，其特征在于，当毕赤酵母采用摇瓶发酵方式时，乙醇的添加方式为：一次性补加至诱导培养基中；

5.根据权利要求1所述的添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法，其特征在于，所述毕赤酵母的发酵罐发酵具体指5l发酵罐高密度发酵，发酵过程中：毕赤酵母菌液接种量为10％；生长阶段发酵温度为30℃，甲醇诱导阶段为28℃，ph为5；甘油补料及甲醇补料阶段关联溶氧，设置溶氧大于20％，转速设置为400～800rpm；在进入甲醇补料阶段的同时，控制蠕动泵，以0.5ml/h/l的流速流加终浓度为0.2％～1.6％的乙醇。

6.根据权利要求1～5任一所述的添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母基因工程菌；所述工程菌发酵表达的重组胶原蛋白为重组人源ii型胶原蛋白，核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。

技术总结本发明涉及生物工程发酵技术领域，提供了一种添加乙醇促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白的方法,即通过在毕赤酵母的摇瓶发酵或发酵罐发酵诱导阶段添加乙醇，提高重组胶原蛋白产量；其中，乙醇的添加量为0.2％～1.6％，添加时间为毕赤酵母发酵诱导初期，添加方式为一次性补加至诱导培养基中，或，以0.5ml/h/L的流速流加至发酵液中。本发明通过在毕赤酵母基因工程菌的摇瓶水平和发酵罐高密度发酵诱导阶段初期添加乙醇，促进毕赤酵母表达重组胶原蛋白，最终蛋白产量提高35％以上。技术研发人员：徐昌志,石伟伟,倪人杰,刘济人,季磊,刘梅梅,张可,章麦菲,吴杭,黄训端,张部昌受保护的技术使用者：安徽大学技术研发日：技术公布日：2024/11/4