一种以生物酶为催化剂合成水杨酸甲酯类化合物的方法

本发明属于生物酶催化合成，具体涉及一种以生物酶为催化剂合成水杨酸甲酯类化合物的方法。

背景技术：

1、水杨酸甲酯类化合物是一种重要的化工原料。比如，水杨酸甲酯可用于制造杀虫剂、杀菌剂、香料、涂料、化妆品油墨及纤维助染剂等。水杨酸甲酯类似物如苯甲酸甲酯的用途也非常广泛，它不仅可用于配制菠萝、草莓、樱桃等香料，还可以作为原料广泛应用于有机合成及作为溶剂使用。邻甲基苯甲酸甲酯可广泛用作医药合成中间体，如合成盐酸多塞平。盐酸多塞平是用于治疗抑郁症及焦虑性神经症的药，其作用在于抑制中枢神经系统对5-羟色胺及去甲肾上腺素的再摄取，从而使突触间隙中这二种神经递质浓度增高而发挥抗抑郁作用，也具有抗焦虑和镇静作用。间甲基苯甲酸甲酯可用作医药、农药、染料中间体和有机合成中间体。对甲基苯甲酸甲酯常用作有机合成的溶剂，可用于涂料、香料、香精和颜料等的生产。2-乙氧基苯甲酸甲酯因其芳香和香甜的气味，常被用作香料和香精的成分，同时它也可以作为有机溶剂，在某些化学反应和实验中被使用。因此，对于水杨酸甲酯类化合物的有效合成方法逐渐成为众多有机合成工作者的研究目标。

2、在工业上，水杨酸甲酯类化合物多采用浓硫酸催化水杨酸和甲醇酯化而成。但该方法反应时间长，产率较低且容易对环境造成污染。其他水杨酸甲酯类化合物的合成普遍也是通过是采用其对应的酸和甲醇在相应催化剂的作用下合成的。常用的催化剂有混合酸类、磺酸类、lewis酸催化剂、杂多酸、固体超强酸、离子交换树脂、硫酸氢钠。但这些催化剂仍存在各自的缺点。如杂多酸容易造成催化剂的流失，固体超强酸重复利用率低，

3、因此，开发一种反应条件温和，操作简便，污染小，绿色安全，且产品纯度高的以生物酶为催化剂合成水杨酸甲酯类化合物的方法至关重要。

技术实现思路

1、为解决上述技术缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种反应条件温和，操作简便，污染小，绿色安全，且产品纯度高的以生物酶为催化剂合成水杨酸甲酯类化合物的方法。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种以生物酶为催化剂合成水杨酸甲酯类化合物的方法，其以其他水杨酸酯类化合物和甲醇为原料，以水杨酸结合蛋白酶2（sabp2）为催化剂，催化其他水杨酸酯类化合物转化成水杨酸甲酯类化合物。

3、本发明通过如下技术方案来实现：

4、步骤1、提供具有较高转化率和催化活性以及广底物谱的水杨酸结合蛋白酶2（sabp2）。

5、进一步地，提供编码sabp2的基因，基因序列如seq id no.1所示，蛋白质序列如seq id no.2所示。

6、进一步地，提供携带上述基因的载体。

7、进一步地，提供表达上述基因的微生物细胞。

8、在一种实施方式中，重组菌以pet-21a(+)为表达载体。

9、在一种实施方式中，重组菌以bl21（de3）为宿主菌。

10、步骤2、探究步骤1中得到的sabp2催化水杨酸甲酯合成的最适甲醇含量，优选为20%。

11、进一步地，以得到的sabp2催化水杨酸甲酯合成的最适甲醇含量为sabp2催化合成其他水杨酸甲酯类化合物的条件，催化其他水杨酸甲酯类化合物的合成。

12、步骤3、测定sabp2分别催化水杨酸乙酯水解生成水杨酸和与甲醇转酯生成水杨酸甲酯的相对转化率。

13、优选地，sabp2催化水杨酸乙酯水解的具体实施过程如下：在反应容器先加入一定浓度的水杨酸乙酯和0.1m ph7.4 pb，震荡混匀，最后加入一定浓度的sabp2，立即将反应容器于30℃水浴条件下反应一定的时间，高效液相色谱（hplc）检测转化率

14、优选地，sabp2催化水杨酸甲酯合成的具体实施过程如下：在反应容器先加入一定浓度的水杨酸乙酯，再加入20%甲醇（v/v）和0.1m ph7.4 pb，震荡混匀，最后加入一定浓度的sabp2，立即将反应容器于30℃水浴条件下反应一定的时间，高效液相色谱（hplc）检测转化率。

15、步骤4、测定sabp2催化水杨酸乙酯转化成水杨酸甲酯随时间的转化率。

16、步骤5、测定sabp2催化苯甲酸乙酯转化成苯甲酸甲酯随时间的转化率。

17、步骤6、sabp2催化其他水杨酸酯类化合物转化成水杨酸甲酯类化合物。

18、在本发明的一种较佳实例1中，详细说明了细菌培养基与实验试剂的配制。

19、在本发明的一种较佳实例2中，详细说明了sabp2重组质粒的获得。

20、在本发明的一种较佳实例3中，详细说明了大肠杆菌原核表达sabp2的过程。

21、在本发明的一种较佳实例4中，详细说明了ni-琼脂糖凝胶6ff（his标签纯化树脂）纯化sabp2的过程。

22、在本发明的一种较佳实例5中，详细说明了sds-page鉴定sabp2纯度的过程。

23、在本发明的一种较佳实例6中，详细说明了sabp2蛋白浓度测定。

24、在本发明的一种较佳实例7中，详细说明了测定sabp2催化水杨酸乙酯转化成水杨酸甲酯的最适甲醇浓度。

25、在本发明的一种较佳实例8中，详细说明了测定sabp2催化水杨酸乙酯水解生成水杨酸和转酯生成水杨酸甲酯的相对转化率。

26、在本发明的一种较佳实例9中，详细说明了测定sabp2催化水杨酸乙酯转化成水杨酸甲酯随时间的转化率。

27、在本发明的一种较佳实例10中，详细说明了测定sabp2催化苯甲酸乙酯转化成苯甲酸甲酯随时间的的转化率。

28、在本发明的一种较佳实例11中，详细说明了sabp2催化邻乙氧基苯甲酸乙酯和甲醇反应生成邻乙氧基苯甲酸甲酯。

29、在本发明的一种较佳实例12中，详细说明了sabp2催化2,4-二羟基苯甲酸乙酯和甲醇反应生成2,4-二羟基苯甲酸甲酯。

30、在本发明的一种较佳实例13中，详细说明了sabp2催化3-乙酰苯甲酸乙酯和甲醇反应生成3-乙酰苯甲酸甲酯。

31、在本发明的一种较佳实例14中，详细说明了sabp2催化邻甲基苯甲酸乙酯转化成邻甲基苯甲酸甲酯。

32、在本发明的一种较佳实例15中，详细说明了sabp2催化间甲基苯甲酸乙酯转化成间甲基苯甲酸甲酯。

33、在本发明的一种较佳实例16中，详细说明了sabp2催化对甲基苯甲酸乙酯转化成对甲基苯甲酸甲酯。

34、在本发明的一种较佳实例17中，详细说明了sabp2催化3,5-二甲基苯甲酸乙酯转化成3,5-二甲基苯甲酸甲酯。

35、在本发明的一种较佳实例18中，详细说明了sabp2催化4-乙炔苯甲酸乙酯转化成4-乙炔苯甲酸甲酯。

36、在本发明的一种较佳实例19中，详细说明了sabp2催化5-甲基水杨酸乙酯转化成5-甲基水杨酸甲酯。

37、在本发明的一种较佳实例20中，详细说明了sabp2催化对羟基苯甲酸丙酯转化成对羟基苯甲酸甲酯。

38、在本发明的一种较佳实例21中，详细说明了sabp2催化苯甲酸丙酯转化成苯甲酸甲酯。

39、在本发明的一种较佳实例22中，详细说明了sabp2催化水杨酸丙酯转化成水杨酸甲酯。

40、在本发明的一种较佳实例23中，详细说明了sabp2催化水杨酸苯酯转化成水杨酸甲酯。

41、在本发明的一种较佳实例24中，详细说明了sabp2催化苯甲酸苯酯转化成苯甲酸甲酯。