具有降血糖活性的松茸低聚肽的制备方法和应用与流程

本发明属于天然产物提取，具体涉及一种具有降血糖活性的松茸低聚肽的制备方法和应用。

背景技术：

1、鲜松茸形若伞状，色泽鲜明，质地细密，有浓郁的特殊香气。松茸对生长环境要求很高，需要与松树形成菌根方能生长，国内主要产于四川、云南、青藏高原一带。其自身富含蛋白质、多糖等，营养丰富。现有研究多针对松茸多糖组分的活性展开，仅有少量以松茸肽为研究对象。

2、202111322755.x公开了一种松茸蛋白肽的制备工艺，包括：(1)向松茸中加入水，采用碱溶酸沉法进行提取蛋白，得蛋白提取液；(2)对所述的蛋白提取液采用风味蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解，获得蛋白肽提取液；(3)对所述的蛋白肽提取液进行透析脱除盐溶液处理后，冷冻干燥，得所述的松茸蛋白肽。该方法所得松茸蛋白肽具有较高的抗氧化活性。

3、202110532177.6公开了一种松茸子实体蛋白源性抗氧化水解肽的制备方法，包括松茸蛋白粉的提取和水解松茸蛋白粉，所述松茸蛋白粉的提取是将松茸子实体预处理后，溶解在ph为9.5的碱溶液中，进行超声提取，最后调节ph至8.7～9.2，在72～76℃下进行碱提取1.3～1.6h，离心取上清液进行盐析，再进行透析和冷冻干燥。该方法所得松茸蛋白肽具有较高的抗氧化水解活性。

4、可见，现有技术针对松茸肽的活性研究也大多集中于抗氧化、抗炎症、调节免疫等功效，对于其降糖能力少有涉及，并未对松茸的活性进行充分开发利用。

5、当下，ⅱ型糖尿病正是严重的公共卫生问题之一，而目前的降糖药物多具有引起胃肠道不适、腿部肿胀等毒副作用。因此将安全可靠的天然产物资源用于制备降糖药物，具有良好的开发前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于开发一种从松茸高效提取低聚肽的方法，并考察松茸低聚肽的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，以及降血糖功效，以期将其用于制备降糖药物。

2、为实现上述目的，本发明首先提供了一种具有降血糖活性的松茸低聚肽的制备方法，其包括以下步骤：

3、a、取鲜松茸冻干后粉碎过筛，得松茸粉；

4、b、碱提酸沉法提取松茸蛋白：将步骤a所得松茸粉和水混合，调节体系ph至8.0～10.0，然后于40～70℃进行提取，固液分离，得到上清液和提取渣，然后再重复提取1～2次，合并上清液，得到提取液；调节所得提取液ph至1.0～5.0，静置后，经离心，所得固体经冷冻干燥，得松茸蛋白；

5、c、酶解松茸蛋白制备肽粗品：将步骤b所得松茸蛋白加水溶解，调节体系ph至6.0～9.0，然后按松茸蛋白质量与酶活之比为0.1～3g：3000u/g，加入中性蛋白酶，于40～60℃进行酶解，酶解完毕后进行灭酶，灭酶后的酶解液经离心，收集上清液，上清液经浓缩(常温下减压浓缩)和冷冻干燥，得肽粗品；

6、d、大孔吸附树脂洗脱：将步骤c所得肽粗品加水溶解，上样至大孔吸附树脂交换柱，依次以25％、50％、75％和100％体积分数乙醇水溶液进行梯度洗脱，测定洗脱液在214nm处的吸光度，分别收集25％、50％、75％和/或100％体积分数乙醇水溶液的洗脱液，洗脱液经浓缩(常温下减压浓缩)和冷冻干燥，得松茸低聚肽。

7、其中，上述制备方法，步骤a中，所述冻干为冻干至含水量3wt％以下。

8、其中，上述制备方法，步骤a中，所述过筛为过120目标准筛。

9、其中，上述制备方法，步骤b中，所述松茸粉和水的固液比为1～2g：20ml。

10、其中，上述制备方法，步骤b中，采用0.5～1mol/l的氢氧化钠溶液调节体系ph至8.0～10.0。

11、其中，上述制备方法，步骤b中，每次提取时，在搅拌下提取1～4h。

12、其中，上述制备方法，步骤b中，采用0.5～1mol/l的盐酸溶液调节所得提取液ph至1.0～5.0。

13、优选的，上述制备方法，步骤b中，调节所得提取液ph至4.0(松茸蛋白等电点，见图1)。

14、其中，上述制备方法，步骤b中，所述静置为静置过夜。

15、其中，上述制备方法，步骤b中，所述离心的转速为2000～5000r/min。

16、本发明步骤b中，“再重复提取1～2次”表示步骤b总提取次数为2～3次；以“再重复提取1次”为例，具体操作为：将步骤a所得松茸粉和水混合，调节体系ph至8.0～10.0，然后于40～70℃进行提取，固液分离，得到上清液1和提取渣1，将提取渣1和水混合，调节体系ph至8.0～10.0，然后于40～70℃进行提取，固液分离，得到上清液2和提取渣2，将上清液1和上清液2合并，即为提取液。

17、其中，上述制备方法，步骤c中，所述中性蛋白酶为dispase，其酶活为10～100u/mg。

18、优选的，上述制备方法，步骤c中，所述松茸蛋白质量与酶活之比为1～2g：3000u/g。

19、其中，上述制备方法，步骤c中，所述松茸蛋白和水的固液比为1～5g：20ml。

20、其中，上述制备方法，步骤c中，采用0.5～1mol/l的氢氧化钠溶液调节体系ph至6.0～9.0。

21、优选的，上述制备方法，步骤c中，调节体系ph至7.5(中性蛋白酶的最适ph)。

22、其中，上述制备方法，步骤c中，酶解时，在搅拌下酶解1～4h。

23、其中，上述制备方法，步骤c中，所述灭酶为在沸水中加热灭酶5～20min。

24、其中，上述制备方法，步骤c中，所述离心的转速为2000～5000r/min。

25、其中，上述制备方法，步骤d中，所述大孔吸附树脂为da201-c大孔吸附树脂。

26、其中，上述制备方法，步骤d中，所述肽粗品和水的固液比为10～20mg/ml。

27、其中，上述制备方法，步骤d中，上样量为10～20ml。

28、其中，上述制备方法，步骤d中，洗脱时，流速为1～3ml/min。

29、其中，上述制备方法，步骤d中，仅收集50％体积分数乙醇水溶液的洗脱液。

30、本发明大孔吸附树脂洗脱时，依次以25％、50％、75％和100％体积分数乙醇水溶液进行梯度洗脱，通过测定不同体积分数乙醇水溶液洗脱下的洗脱液在214nm处的吸光度，判断该体积分数乙醇水溶液下的组分是否洗脱完全，以25％体积分数乙醇水溶液为例，测定该体积分数下的洗脱液在214nm处的吸光度，当该组分的洗脱峰结束，且后续流出液的吸光度保持在较低水平时，表明25％体积分数乙醇水溶液的组分已洗脱完全，此时换成50％体积分数乙醇水溶液继续进行洗脱，以此类推。

31、经活性检测结果可知，本发明中经过大孔吸附树脂交换柱50％体积分数乙醇水溶液洗脱所得组分d2，对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性最高，为获得更高活性的松茸低聚肽，步骤d中，可只收集50％体积分数乙醇水溶液的洗脱液。当然以25％、75％和100％体积分数乙醇水溶液洗脱所得组分d1、d3和d4，也具有一定α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性，本发明也可以收集相应体积分数乙醇水溶液的洗脱液，得到对应低聚肽。

32、本发明还提供了一种松茸低聚肽，其采用上述方法制备所得。

33、本发明还提供了采用上述方法制备所得松茸低聚肽在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂和/或α-淀粉酶抑制剂中的应用。

34、本发明还提供了采用上述方法制备所得松茸低聚肽在制备降血糖食品、降血糖保健品或降血糖药品中的应用。

35、本发明的有益效果：

36、本发明提高松茸生物活性利用率。本发明选定中性蛋白酶，将松茸蛋白进行酶解，通过温度、时间对反应进行精准控制，既能凭借内切方式切断处于肽链内部的肽键，促成短链肽的生成，同时能以外切方式切断肽链末端，能针对目标蛋白质进行高效、精确的分解，利于短肽生成，从而得到小分子活性肽；具有可控性及效率更高等优点，所制得的肽产品，成分安全、纯净，能高效被人体吸收。

37、本发明松茸低聚肽的活性高。本发明采用酶解法得到高α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶抑制活性的酶解物，通过分离纯化获得活性更高的组分。当经过大孔吸附树脂交换柱分离纯化后，所制得的肽对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的半数抑制浓度最高分别为ic50：10.25mg/ml、26.85mg/ml，具备较强降糖潜力。

38、本发明松茸低聚肽能够高效发挥作用。本发明低聚肽可以以口服方式进入体内，由于所制得肽段分子量较小，在消化道内，小肽在胃肠道中消化、吸收速度与效果均优于蛋白质和游离氨基酸，可高效发挥降糖作用，具有强稳定性。

39、本发明拓展了天然来源降血糖产品，可作为防治糖尿病的原料，将所得肽粉辅以微晶纤维素、甘露醇、硬脂酸镁、柠檬酸等，制成具有降血糖作用的肽粉片剂，作为植物源天然降糖产品进行进一步开发，填补松茸低聚肽降血糖领域空白，并且肽粉片剂食用方式简单。