一种用于原发性肝细胞癌检测的分子标记物及其应用的制作方法

本发明属于基因检测，具体涉及一种用于原发性肝细胞癌检测的分子标记物及其应用。

背景技术：

1、原发性肝癌(primary liver cancer,phc)是全球第6大常见癌症，其起病隐匿，病情进展快，预后差，具有较高的发病率及病死率。流行病数据显示，乙肝病毒携带者达9000万，肝癌例数占全球54％，肝癌是一个严重威胁人民生命健康的公共卫生问题。

2、肝脏隐匿在上腹深部，肿大早期不易发现，同时肝脏有强大的代偿能力，早期常无症状或者症状并不明显，患者通常仅仅表现出非特异性的消化道症状，如食欲不振、恶心、呕吐等，因此很难在早期确诊。据相关资料显示，直径小于5厘米的小肝癌根治性手术切除后的5年生存率达72.9％，直径小于2厘米的肝癌手术切除后的5年生存率达86.4％，然而现阶段肝癌总体临床病例的5年生存率只有20％左右，超过85％的肝癌患者在就诊时已经是中晚期，患者生存期不足2年。早筛早诊早治对于肝癌的诊断和治疗有重要意义，同时还可以显著提高患者的生存期和生活质量，也可以大大减少患者的治疗费用。

3、目前临床上常用的肝癌的诊断方法包括：腹部超声、血清学甲胎蛋白(afp)检测、x线计算机断层成像(ct)、磁共振成像(mri)及细针穿刺活检等。甲胎蛋白afp作为广泛使用的原发性肝癌肿瘤标志物，大于400μg/l或含量不断上升时，有确定的诊断意义。然而小肝癌病人中有40％左右甲胎蛋白含量为正常水平，同时非恶性疾病，如急慢性肝炎、重症肝炎恢复期、肝硬化、先天性胆管闭塞，也会导致甲胎蛋白升高。因此，据相关研究统计，单独血清甲胎蛋白afp检测对早期肝癌诊断的灵敏度约为32％-49％，灵敏度较低。彩超联合血清甲胎蛋白检测可将肝癌诊断的敏感性提升至63％左右，但灵敏度仍较低。其它影像学检查如ct或mri等有辐射性，多次检测对人体健康存在一定的危害性，且花费较高。细针穿刺活检等属有创操作，患者依从性较低。

4、本领域仍然需要一种无创、低成本、高敏感度和特异性、适于大规模筛查的准确的早期肝癌诊断方法。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种用于原发性肝细胞癌检测的分子标记物，该分子标志物甲基化水平检测试剂能够在制备原发性肝细胞癌检测产品中得到有效的应用。其是以hg38基因组为参比基因组，通过检测chr17：30970241-30970741基因组区域cpg位点的甲基化水平对原发性肝细胞癌的筛查和辅助诊断具有较好的灵敏度和特异性，可以用于区分原发性肝细胞癌患者样本与肝脏良性疾病(肝硬化、肝炎等)患者和健康人群样本。

2、本发明的第二目的在于为原发性肝细胞癌的筛查和辅助诊断提供了一种无创、方便、安全、快捷且准确度高的甲基化水平检测产品。

3、本发明通过以下技术方案实现：

4、一种用于原发性肝细胞癌检测的分子标记物，所述分子标记物为chr17：30970241-30970741基因组区域序列中至少包含一个cpg位点的核酸分子；

5、所述基因组区域来自于hg38人类参考基因组。

6、一种分子标记物甲基化水平检测试剂在制备原发性肝细胞癌检测产品中的应用，包含所述的用于原发性肝细胞癌检测的分子标记物。

7、作为优选地，所述分子标记物为位于如下至少包含一个cpg位点的区域：

8、所述区域1、区域2、区域3、区域4；

9、所述区域1选自chr17：30970270-30970355，所述区域2选自chr17：30970348-30970428，所述区域3选自chr17：30970452-30970550，所述区域4选自chr17：30970629-30970741。

10、作为优选地，所述检测产品为试剂、试剂盒、芯片和测序文库中的任意一种。

11、作为优选地，当检测产品为试剂时，所述检测试剂包括用于检测所述区域1的核酸组合1、用于检测所述区域2的核酸组合2、用于检测所述区域3的核酸组合3、用于检测所述区域4的核酸组合4中的一种或多种组合。

12、作为优选地，所述核酸组合1包括引物组合1，所述核酸组合2包括引物组合2，所述核酸组合3包括引物组合3，所述核酸组合4包括引物组合4；

13、所述引物组合1的碱基序列与seq id no.1-2所示的碱基序列具有至少90％的一致性；

14、所述引物组合2的碱基序列与seq id no.4-5所示的碱基序列具有至少90％的一致性；

15、所述引物组合3的碱基序列与seq id no.7-8所示的碱基序列具有至少90％的一致性；

16、所述引物组合4的碱基序列与seq id no.10-11所示的碱基序列具有至少90％的一致性。

17、作为优选地，所述核酸组合1还包括探针1，所述核酸组合2还包括探针2，所述核酸组合3还包括探针3，所述核酸组合4还包括探针4；

18、所述探针1的碱基序列与seq id no.3所示的碱基序列具有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的一致性；

19、所述探针2的碱基序列与seq id no.6所示的碱基序列具有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的一致性；

20、所述探针3的碱基序列与seq id no.9所示的碱基序列具有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的一致性；

21、所述探针4的碱基序列与seq id no.12所示的碱基序列具有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的一致性。

22、作为优选地，所述分子标记物甲基化水平通过如下方法进行检测：msp法、高通量测序法、甲基化特异性高效液相层析法、ddpcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶法和methylight法中的任意一种；

23、所述测序法包括自重亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法或边合成边测序法。

24、一种原发性肝细胞癌检测试剂盒，包括所述的核酸组合、阳性对照品、阴性对照品、内参基因的检测引物、内参基因的检测探针、dna聚合酶和缓冲液。

25、作为优选地，所述试剂盒的检测样本为离体血液样本或离体组织样本和离体白细胞样本。

26、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

27、(一)本发明提供了一种用于原发性肝细胞癌检测的分子标记物，该分子标志物甲基化水平检测试剂能够在制备原发性肝细胞癌检测产品中得到有效的应用。其是以hg38基因组为参比基因组，通过检测chr17：30970241-30970741基因组区域cpg位点的甲基化水平对原发性肝细胞癌的筛查和辅助诊断具有较好的灵敏度和特异性，可以用于区分原发性肝细胞癌患者样本与肝脏良性疾病(肝硬化、肝炎等)患者和健康人群样本。

28、(二)本发明为原发性肝细胞癌的筛查和辅助诊断提供了一种无创、方便、安全、快捷且准确度高的甲基化水平检测产品。

29、(三)本发明通过检测chr17：30970241-30970741区域序列中的cpg位点的甲基化水平，可以鉴别样本来源的患者是否是原发性肝细胞癌患者。

30、若目标样本来自原发性肝细胞癌患者，则上述区域的cpg位点为高甲基化水平，若目标样本来自健康人或肝脏良性疾病(肝硬化、肝炎等)患者，则在上述区域cpg位点为低甲基化水平。

31、上述区域的cpg位点可以用于区分原发性肝细胞癌患者样本和健康人样本，以及原发性肝细胞癌患者样本和良性疾病(肝硬化、肝炎等)患者样本。

32、(四)本发明为原发性肝细胞癌早筛和辅助诊断提供了良好的分子标志物，具有无创、方便、安全、快捷、准确度高的优势。

33、(五)本发明提供的检测分子标记物甲基化水平的检测试剂及应用可以提高肝细胞癌高风险人群及普通人群中的原发性肝细胞癌的检出率，从而满足肝细胞癌早筛早诊的临床需求。降低肝细胞癌患者的死亡率，降低医疗费用的支出。