一种基于PCR的多色荧光通道检测方法及应用与流程

本发明涉及基因检测，尤其涉及一种基于pcr的多色荧光通道检测方法及应用。

背景技术：

1、病原体是指能够导致人类或动植物感染性疾病的生物，包括病毒、支原体、衣原体、细菌、真菌、原虫、寄生虫等微生物。病原体检测是临床诊断和防控感染性疾病的重要手段，需要快速、全面、准确地鉴别病原体的物种、型别、耐药性和毒力等。现有的基因检测技术中，在保证特异性的基本前提下，对于病原体检测的要求主要有两个方向：一是快检化，包括现场快检化；如现有的恒温扩增技术，以lamp和rpa技术为代表的快速扩增技术可以缩短反应时间，以anca技术为代表的利用ago蛋白进行级联酶切的技术可以快速获得可检测的荧光信号(jang h,song j,kim s,et al.anca:artificial nucleic acid circuitwith argonaute protein for one-step isothermal detection ofantibiotic-resistantbacteria[j].nature communications,2023,14(1):8033.)。二是信号可视化及反应一锅法化；这个方向以将恒温扩增技术和crispr技术结合对病原体进行快速检测为代表。如joung等人利用恒温扩增技术和crispr-cas12b结合对新冠病毒进行快速检测，可以在40分钟内得到结果(joung j,ladhaa,saito m,et al.point-of-care testing forcovid-19using sherlock diagnostics[j].medrxiv,2020.)；liu等人将crrna酰化后，封闭crispr-cas12a的切割能力，在利用恒温扩增技术rpa富集模板后，利用365nm的紫外线对crrna解除封闭，使荧光探针被切割并释放信号。据此，他们实现了将恒温扩增反应和crispr反应一锅化(liu p,liny,zhuo x,et al.universal crrna acylation strategyfor robust photo-initiated one-pot crispr–cas12a nucleic acid diagnostics[j].angewandte chemie international edition,2024:e202401486.)。

2、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性，即dna序列中单个碱基的差别。在自然界中，snp广泛存在，对于snp的检测分析在药物研制、临床检验和基因突变诊断等方面具有重要意义。对于snp分型的检测相较于病原体检测更为复杂，其主要原因在于，snp本身仅存在一个碱基差异，识别难度大于多个碱基差异的indel和大片段差异的病原体检测。现有技术中针对snp分型检测的方法主要有以下几种：

3、(1)最传统的基于限制性内切酶识别的方法，通过酶切和区带电泳相结合来识别酶切位点，进而间接的识别酶切位点上是否存在对应的snp错配。这需要用到对应的限制性内切酶，成本较高，通量一般。

4、(2)基于直接测序的方法，如对模板进行多重pcr后进行高深度测序，进而获得snp信息，成本较高，通量较低。

5、(3)以taqman为代表的技术。先用常规引物扩增富集携带snp的模板，同时引入荧光探针，荧光探针与snp所在的序列互补。当荧光探针与snp完全互补时，荧光探针的结合效率最高，荧光探针得以快速水解并释放信号。利用两条分别对应不同snp的荧光探(多色通道)，即可以获得snp的信息，成本较高，通量较低。

6、(4)基于探针芯片的方法。探针末端位于snp检测位点的5’端上游并与snp紧密相邻，当模板和探针结合时，被荧光基团修饰的dntp识别snp位点并延伸掺入探针。因此，探针簇可以富集特定的dntp，发出特定的荧光信号，进而识别出snp信息。与此类方法基本原理类似的还有snapshot技术。这类技术的特点在于当一份样本需要检测多个位点时，成本低，通量高。但当一份样本仅需检测少量位点时，这类技术的平均检测成本和通量都不如传统技术。

7、(5)以hrm((high-resolution melting curve)，高分辨率溶解曲线)为代表的方法。扩增的产物序列由于snp的差异，其溶解曲线也有所差异，借助高分辨率的机器可以对snp进行分型。但hrm对dna模板的浓度均一化要求较高，导致在实际的使用过程中，需要均一化dna浓度，实际通量较低。同时，hrm需要配合使用高饱和度且不干扰pcr反应的核酸染料，这类核酸染料价格高昂，导致hrm的实施成本较高。

8、(6)基于延伸阻滞的原理来识别snp。当引物的3’末端最后一个碱基与snp位点发生错配时，引物的延伸会受到阻滞，抑制pcr扩增。延伸阻滞pcr的特异性由错配碱基的类型和pcr退火温度决定。当引物识别到正确配对的模板时，可以获得对应的产物，即arms(扩增阻滞突变系统)。再通过区带电泳来识别原始模板基因。另一种方法是，通过在特异性引物的5’末端引入tag序列，同时加入偶联荧光基团和淬灭基团的探针(碱基序列同tag序列)或掺入荧光基团探针和与荧光基团互补的携带淬灭基团的探针。初始的荧光探针在空间上随意卷曲后与另一端的淬灭基团接触或与淬灭探针互补后与淬灭基团接触，荧光信号低。掺入产物链的荧光基团和淬灭基团会被隔离，再实现荧光信号的增长。这类技术使用通用探针，具有灵活性好，成本低，通量高的优点。但是这两种技术的荧光信号强度都相对有限，且对dna聚合酶识别错配的底层原理解释不清晰，可预测性差，往往依赖于touch down pcr来部分抑制非特异扩增。这导致其在实际操作过程中需要将定性实验转化为定量实验，在保证准确性的前提下，实际操作较为复杂。

9、(7)rnase h依赖性pcr基因分型技术(rhamp snp genotyping)。rnase hii酶可以识别正常互补的dna-rn-dna/dna的结构，并在rna的5’端进行切割。利用这一特点，rnasehii酶可以识别snp错配。而rna碱基与模板的snp错配时，特异性引物的3’端的blocking基团则可以封闭引物的延伸，抑制pcr扩增，从而识别snp；最后通过类似taqman的信号增长机制，获得用于分型的荧光信号差异。这类技术也使用通用探针，具有灵活性好，成本低，通量高的优点。但该技术需要在特异性引物中间修饰rna碱基，在3’末端修饰blocking基团且特异性引物序列较长，成本较高。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种基于pcr的多色荧光通道检测方法及应用，在step体系中添加了热稳定的rnase hii核糖核酸内切酶及掺杂了rna碱基和lna碱基的荧光探针，利用rnase hii核糖核酸内切酶对探针进行酶切，使探针两端偶联的荧光基团和淬灭基团彻底远离，发出强荧光信号，具有成本低、特异性高、多色通道、信号强的优点。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、本发明一方面提供一种基于pcr的多色荧光通道检测方法，包括以下步骤：

4、s1：提取待测样品的全基因组dna；

5、s2：将步骤s1中提取的dna作为模板，在同步双酶pcr反应体系中进行同步双酶pcr反应；其中，同步双酶pcr反应体系包括dna模板5-50ng，特异性引物400-800nm，通用反向引物400-800nm，荧光探针100-200nm，rnase hii酶25-50mu，pcrmix 1×，其它体积用水补足；

6、s3：将步骤s2中的反应产物置于激发光下，读取不同荧光信号，完成检测。

7、进一步的，步骤s2中所述的荧光探针有两条，每条荧光探针均在5’端的+7位掺杂lna碱基，+14位掺杂rna碱基；5’端的+3～+7位以及+15～+18位序列互补；且所述荧光探针的两端分别偶联荧光基团和淬灭基团。

8、进一步的，两条所述荧光探针的核苷酸序列分别如seq id no.1及seq id no.2所示。

9、进一步的，步骤s2中所述的特异性引物为特异性长引物或者工作浓度比为1:3的特异性长引物与特异性短引物混合液。

10、进一步的，所述特异性长引物是在特异性引物5’端引入与荧光探针序列相同的tag，并在tag和特异性引物序列间插入碱基bridge序列，bridge序列与荧光探针中5’末端的悬挂碱基ac互补；

11、所述特异性短引物为特异性长引物去掉bridge和tag后的引物。

12、进一步的，步骤s2中同步双酶pcr的反应程序为：热启动94℃5min，解旋94℃30s，退火加酶切61℃～63℃ 1min，扩增35个循环，最后63～65℃终延伸兼终酶切10min。

13、本发明另一方面提供一种pcr反应用荧光探针，所述荧光探针掺杂有lna碱基和rna碱基，且所述荧光探针的两端分别偶联荧光基团和淬灭基团。

14、此外，本发明还提供了一种pcr反应体系，包括dna模板5-50ng，特异性引物400-800nm，通用反向引物400-800nm，荧光探针100-200nm，rnase hii酶25-50mu，pcrmix 1×，其它体积用水补足。

15、此外，本发明还提供了一种包含如前所述的pcr反应体系的产品。

16、优选的，所述产品包括试剂盒。

17、本发明的有益效果是：

18、1、本发明中公开了一种基于pcr的多色荧光通道检测方法，通过在pcr反应体系中加入rnase hii酶，并设计特异性引物和掺入rna碱、lna碱基的荧光探针，利用rnase hii酶的内切酶特性及其仅在掺入rna碱基的链上产生缺刻的特性，将rnase hii酶和taq酶进行同步反应。这一策略既不影响taq酶的聚合反应，又能保证荧光探针水解后彻底释放荧光信号。

19、2、本发明中设计的荧光探针掺杂有lna碱基和rna碱基，且所述荧光探针的两端分别偶联荧光基团和淬灭基团，在与互补链杂交时，形成了dna-rn-dna/dna的结构；rnasehii酶可以识别上述结构，并在rna碱基的5’端进行切割，使探针两端偶联的荧光基团和淬灭基团彻底远离，发出强荧光信号。

20、3、本发明中设计的特异性长引物在特异性引物5’端引入与荧光探针序列相同的tag，并在tag和特异性引物序列间插入两个碱基bridge序列，形成从5’端到3’端依次为tag序列、bridge和特异性序列的特异性长引物；通过引入6个碱基对的发夹结构封闭tag序列后，tag序列和bridge序列共同组成6bp的stem结构，其3’端的特异性序列与靶序列特异性结合，将特异性序列以外的碱基进行封闭，特异性引物仅依赖降低了长片段特异性序列带来的二级结构引发非特异性扩增的概率；封闭后的接头tag序列不易引发额外的引物二聚体，降低了背景噪声，简化了预测引物二聚体的计算量。

21、4、本发明中当长特异性引物与靶序列正确匹配时，长特异性引物得以延伸将tag和bridge碱基引入pcr产物中并获得与tag序列互补的反义链。荧光探针和与tag互补的反应链在61～63℃的温度下互补杂交，形成dna-rn-dna/dna结构。进而实现rnase hii酶的识别和荧光探针的切割。

22、5、本发明中当反应体系中将部分长特异性引物替换为短特异性引物时，由长短特异性引物分别扩增得到的延伸链及互补链随机退火，部分产物形成了由短特异性引物延伸链和长特异性引物互补链配对的dna链。这样的dna链会暴露出一个悬挂单链，且该悬挂单链与荧光探针互补。使荧光探针可以在不需要和特异性引物延伸链竞争的前提下和互补链结合，提高荧光探针的退火效率。同时，长特异性引物的bridge结构在互补链的悬挂单链的结构作为空间缓冲，可以降低淬灭基团对荧光探针退火形成空间位阻。

23、6、基于本发明中的pcr反应体系，本发明中还设计了特定的pcr反应程序，相对于一般的pcr程序，本发明中在反应的循环阶段采用60℃以上的退火温度(rnase hii酶在70～75℃有最佳活性，在50℃～75℃间均具有活性)，使pcr的引物延伸和探针水解同步进行；循环结束后进行终延伸及酶切的简并步骤，终延伸温度采用63～65℃，使其在荧光探针的tm值附近工作。既保证荧光探针和靶序列的结合效率，又兼顾rnase hii酶的活性对反应温度的要求。

24、7、利用本发明中的pcr方法最终获得的荧光终点信号可以在激发光源下直接目视分析；同时本发明的荧光探针可以兼容多色荧光通道，在病原体检测实验中具有部署灵活，读取信号方便，可以进行多靶点同步分析的优点；采用严格意义上的一锅法反应，部分需要在pcr后二次反应以显色的病原体检测技术有着方便快捷的优势。

25、8、本发明中还对snp错配对pcr反应影响的机理进行了系统性的解释，提出了tpass(temperature-passallele specific system，温选等位特异性系统)理论。snp错配的热稳定性和碱基配对的类型的两个变量共同影响了snp错配对于pcr扩增的严谨性。以临界温度为尺度对snp错配的强弱性进行了严格的横向比对，使大规模设计高特异性的snp分型引物有了明确的理论依据，而不需要用传统的touch down或梯度pcr的策略来对snp分型的最佳退火温度反复试错。