一种基于MB-PCR快速检测柱状黄杆菌的试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、柱状黄杆菌（flavobacterium cloumnare）属于属黄杆菌目、黄杆菌科、黄杆菌属，是一种严格需氧的革兰阴性菌，广泛存在于世界各地的水体和土壤环境中，能感染多种淡水鱼类，包括鲑科、鲤科、鲇科、鲈科等种属，形成烂鳃和体表溃疡的典型症状，带来高死亡率，给水产养殖业带来了重大经济损失。为了治疗柱状黄杆菌感染，滥用抗生素从而导致病原菌产生了耐药性，使鱼病治疗更加困难，同时耐药细菌还可能通过食物链传递到更高等的动物，甚至威胁人类健康。

2、目前，对于柱状黄杆菌的鉴定，一般有细菌生长形态观察、生化鉴定法和血清凝集反应等方法，然而这些方法对细菌纯度和含量要求较高，结果准确度不高，操作繁琐，应用有限。随着细菌鉴定技术的发展以及对检测结果准确度的需求，分子生物学方法逐渐应用到细菌的鉴定中，包括dna同源比对法、dna-rrna原位杂交法、多重pcr技术等，这些方法虽然特异性高，且操作十分简单，对仪器设备要求低，能快速准确的鉴定出病原，但是杂交不稳定，非特异杂交或者非特异扩增较多，在检测灵敏度上有一定局限；也有基因诊断技术，比如环介导等温扩增 (lamp)也应用到细菌的鉴定中，但扩增的快速也导致了终产物的浓度高，交叉污染的概率也大大提高，扩增假阳性高，lamp 扩增因为没有 pcr 的温区切换过程而显得比较紊乱，也不利于后续的定量，且检测灵敏度不够，引物设计困难；随后，也有基于taqman 探针的实时荧光定量pcr方法，具体是柱状黄杆菌上软骨素ac裂解酶基因的113bp核苷酸片段作为靶向基因，可用于被感染鱼组织（血液、鳃和肾等）中柱状黄杆菌的检测和定量，特异性低，检测灵敏度也不够高。

3、分子信标(molecular beacon，mb)是一种有茎环结构的荧光探针，当没有靶序列存在时，mb探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发荧光。在有靶序列存在的情况下，分子信标低温时与互补的靶序列形成稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，还可以进行实时检测。为此，如果能基于分子信标设计一种检测柱状黄杆菌的产品，则有利于监控以及预防柱状黄杆菌的感染，减少鱼类疾病的发生，提高养殖效率和鱼类的生存率。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本发明设计了一种基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒及检测方法。

2、为了实现上述目的，本发明解决技术问题采用如下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括mb-pcr反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品，其中所述mb-pcr反应液包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物、如seq id no.2所示的下游引物、如seq id no.3所示的mb探针。

4、具体地，所述上游引物的序列为5’-ttcggatcggagtc-3’；所述下游引物的序列为5’-tcgtaacaaggtaac-3’；所述mb探针的序列为5’-cagcaa-cctgaagtcggtga-ttgctg-3’。

5、优选地，上游引物和下游引物的工作浓度为0.2μm，mb探针的工作浓度为0.1μm。

6、所述述尿嘧啶-n-糖基化酶能在 25℃下将前期不小心引入的扩增产物中尿嘧啶切断，使其不能成为扩增模板，尿嘧啶-n-糖基化酶在 95℃下失活，不影响接下来dna 作为模板的扩增，从而有效预防由 pcr 产物的污染导致的假阳性结果。

7、所述mb探针全长25bp，其中环结构长度14bp,茎结构长度6bp，mb探针环结构无二级结构，环结构的tm值比茎结构高，mb探针的茎结构使得5”端荧光基团与3’端淬灭基团相抵，由于mb探针的环结构比茎结构tm值高，mb探针优先特异地与目的片段相结合。

8、优选地，所述mb探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有荧光报告基团；所述荧光报告基团为fam，所述荧光淬灭基团为dabcyl。

9、优选地，所述mb-pcr反应液还包括工作浓度为10-100mm kcl、1-50mm且ph为7.5-8.5的tri-hcl、1-3mm mgcl2、1-15mm mgso4、1-2 mm dntp。

10、优选地，所述mb-pcr反应液还包括pcr增强剂，所述pcr增强剂为甜菜碱、二甲基亚砜和甲酰胺。

11、优选地，所述酶混合液组分工作浓度为0.1-10u/μl热启动taq酶、0.005-0.1u/μl尿嘧啶-n-糖基化酶、0.1-5u/μl rna 酶抑制剂。

12、另一方面，本发明提供了一种非诊断目的检测柱状黄杆菌的方法，具体是采用所述的基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒。

13、优选地，所述方法包括以下步骤：

14、s1:提取样本核酸；

15、s2:将步骤s1提取的核酸作为模板，进行pcr扩增反应，反应结束后检测分析。

16、优选地，所述步骤s2中采用20μl的pcr扩增体系，包括13μl mb-rt-pcr反应液、2μl酶混合液、5μl模板。

17、优选地，所述pcr扩增反应条件为：95℃ 2.5min；95℃ 10s，55℃ 30s，37个循环。

18、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

19、本发明基于mb-pcr提供了一种检测柱状黄杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括mb-pcr反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品。本发明的试剂盒能快速检测柱状黄杆菌，克服了传统试剂盒敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷；本发明的试剂盒适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性；并且提高了荧光信号，进一步提高了灵敏度，使检测结果更加准确可靠。

技术特征：

1.一种基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括mb-pcr反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品，其中所述mb-pcr反应液包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物、如seq id no.2所示的下游引物、如seq id no.3所示的mb探针。

2.根据权利要求1所述的一种基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒，其特征在于，所述上游引物和下游引物的工作浓度为0.2μm，mb探针的工作浓度为0.1μm。

3.根据权利要求1所述的一种基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒，其特征在于，所mb探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有荧光报告基团；所述荧光报告基团为fam，所述荧光淬灭基团为dabcyl。

4.根据权利要求1所述的一种基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒，其特征在于，所述mb-pcr反应液还包括工作浓度为10-100mm kcl、1-50mm且ph为7.5-8.5的tri-hcl、1-3mm mgcl2、1-15mm mgso4、1-2 mm dntp。

5.根据权利要求1所述的一种基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒，其特征在于，所述mb-pcr反应液还包括pcr增强剂，所述pcr增强剂为甜菜碱、二甲基亚砜和甲酰胺。

6.根据权利要求1所述的一种基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液组分工作浓度为0.1-10u/μl热启动taq酶、0.005-0.1u/μl尿嘧啶-n-糖基化酶、0.1-5u/μl rna 酶抑制剂。

7.一种非诊断目的检测柱状黄杆菌的方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的基于mb-pcr快速检测柱状黄杆菌的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤s2中采用20μl的pcr扩增体系，包括13μl mb-rt-pcr反应液、2μl酶混合液、5μl模板。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增反应条件为：95℃ 2.5min；95℃ 10s，55℃ 30s，37个循环。

技术总结本发明公开了一种基于MB‑PCR快速检测柱状黄杆菌的试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。所述试剂盒包括MB‑PCR反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品，其中所述MB‑PCR反应液包括MgCl<subgt;2</subgt;、dNTP、(NH<subgt;4</subgt;)<subgt;2</subgt;SO<subgt;4</subgt;、Tri‑HCl、dNTP、水以及核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物、如SEQ ID NO.3所示的MB探针。同时本发明还提供了使用该试剂盒检测柱状黄杆菌的方法，不仅在27min内就能快速检测柱状黄杆菌，该试剂盒还具有高灵敏度、高特异性的特点，检测结果准确可靠。技术研发人员：付英豪,谭杰峰,马铃铃,凌嘉慧,徐艳琼受保护的技术使用者：广州奕昕生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4