一种磁珠法核酸提取试剂盒及核酸提取方法与流程

本发明涉及核酸提取，具体涉及一种磁珠法核酸提取试剂盒及核酸提取方法。

背景技术：

1、核酸提取是从生物样本中提取dna(脱氧核糖核酸)或rna(核糖核酸)的过程，是分子生物学中一项基础而重要的技术。高效的核酸提取技术为基因组分析、疾病诊断、遗传多样性研究、个性化医疗、疫苗开发和分子克隆等提供纯净和高质量的核酸材料，有助于深入了解细菌生物学特性、疾病的发生机制以及开展相关的检测和研究工作，对生物学研究、医学诊断、生物技术等众多领域具有至关重要的意义。

2、传统的细菌核酸提取方法主要包括酚氯仿抽提法、煮沸法和trlzol法等。酚氯仿抽提法是早期较为常用的方法，但操作繁琐、耗时较长，且对实验人员的技术要求较高，同时有机溶剂的使用存在一定的安全风险。煮沸法虽然简单快速，但提取的核酸纯度和质量往往不够理想，容易受到杂质的干扰。trlzol法提取效率高效，是一种广泛用于核酸提取的试剂，但高成本和耗时长成为大规模核酸提取和高通量实验限制因素。随着科技的不断进步，出现了一系列更为先进和高效的核酸提取技术。

3、磁珠法逐渐成为一种备受青睐的方法。磁珠法基于磁珠表面特定的化学修饰，能够特异性地结合核酸分子。磁珠具有超顺磁性，在磁场作用下可以快速聚集和分离，从而实现核酸与其他细胞组分的有效分离。磁珠法作为传统提取方法的延伸，弥补了传统核酸提取劣势，具有以下优点：

4、第一方面，磁珠法具有极高的核酸提取效率，磁珠表面的特异性结合位点能够高效地捕获目标核酸分子，大大减少了核酸的损失。第二方面，磁珠法具有良好的特异性和选择性。磁珠可以根据核酸分子的特性进行精准的识别和结合，不受细胞内其他复杂成分的干扰。这使得提取得到的核酸纯度较高，能够更好地满足后续的分子生物学分析需求，如pcr、基因测序等。第三方面，磁珠法操作简便、自动化程度高。整个提取过程可以通过自动化仪器进行，大大减少了人为操作误差，提高了实验的重复性和准确性。操作人员只需按照设定的程序进行操作，即可获得高质量的核酸提取物，无需具备精湛的实验技术。第四方面，磁珠法相对安全环保。磁珠的使用和分离过程中不涉及有毒有害的有机溶剂，减少了对实验人员和环境的潜在危害。

5、现有的磁珠法核酸提取虽有众多益处，却也不乏局限性：第一，现有磁珠法在裂解过程需要生物活性酶辅助裂解，生物酶成本高，易失活，不便于试剂盒的常温储存和运输。第二，在裂解结合过程中通常需额外加入异丙醇，促进核酸与磁珠结合，异丙醇对人体会产生一定危害，人体吸入或皮肤接触异丙醇会引起头痛、恶心或呼吸困难等。第三，提取裂解时间长，核酸降解风险高，影响核酸提取效率。

6、因此，有必要开发一种低成本、高通量、高效率的磁珠法核酸提取试剂盒和核酸提取方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种磁珠法核酸提取试剂盒和核酸提取方法，裂解成本低，对操作人员的危害性低。

2、本发明第一方面公开了磁珠法核酸提取试剂盒，包括磁珠液、裂解结合液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液，其中，所述裂解结合液包括：盐酸胍、柠檬酸钠、硫酸葡聚糖钠盐和氯化钠。

3、优选的，裂解结合液还包括triton x-100、tcep、氢氧化钠和edta，裂解结合液的ph为5.5-6.8。

4、优选的，裂解结合液各成分的含量为：2-6m盐酸胍、0.01-0.1m柠檬酸钠、0.5m-3m氯化钠、0.05-0.1％w/v硫酸葡聚糖钠盐、0.1-1m氢氧化钠、0.01-0.5m edta、1-10％v/vtriton x-100和0.01-0.5m tcep，ph 5.5-6.8。

5、优选的，第一洗涤液的组成为：0.01m-0.1m edta、0.01m-0.1m tris、0.5m-4m盐酸胍和50％乙醇溶液，ph 6.5-7.0。

6、优选的，第二洗涤液的组成为：70％乙醇溶液，ph 7.0-7.5。

7、优选的，磁珠液包括10-100mg/ml磁珠和去离子水，所述磁珠为硅羟基磁珠、粒径为200nm。

8、优选的，裂解结合液由以下组分组成：2.5m盐酸胍、0.01m柠檬酸钠、2m氯化钠、0.05％硫酸葡聚糖钠盐、0.1m氢氧化钠、0.05m edta、0.5％ triton x-100、0.05m tcep；

9、第一洗涤液由以下组分组成：0.02m edta、0.03m tris、0.5m盐酸胍、20％乙醇溶液；

10、第二洗涤液由以下组分组成：70％乙醇溶液；

11、洗脱液为depc水。

12、本发明第二方面提供基于上述试剂盒的核酸提取方法，包括以下步骤：

13、将200-400μl样本加入到800-1000μl裂解结合液中；

14、取100μl磁珠液加入到裂解结合液中，混匀并孵育，孵育结束后分离磁珠，弃上清；

15、加入800-1000μl第一洗涤液漂洗后，分离磁珠，弃上清；

16、加入800-1000μl第二洗涤液漂洗后，分离磁珠，弃上清；

17、加入80-100μl洗脱液，分离磁珠，取洗脱上清。

18、优选的，裂解结合液的孵育温度为60℃，孵育时长为600-1800秒；第一洗涤液与磁珠的孵育时长为100-200秒；第二洗涤液与磁珠的孵育时长时长为60-150秒；洗脱液与磁珠的孵育时长为180-600秒，孵育温度为60℃。

19、优选的，通过磁珠纯化仪提取样本的核酸，核酸提取方法为：

20、在多孔深孔板中依次加入以下试剂：第一列孔位中加入磁珠液、第二列孔位中加入裂解结合液、第三列孔位中加入第一洗涤液、第四列孔位中加入第二洗涤液、以及第五列孔位中加入洗脱液；

21、将样本加入到第二列孔位后，将多孔深孔板放入磁珠纯化仪内，并安装磁棒套；

22、设定并运行提取程序；

23、取出多孔深孔板，并从第五列孔位中取出洗脱上清；

24、所述提取程序的步骤包括：

25、步骤1：30秒内，将第一列孔位的磁珠转移到第二列孔位内，并混匀；

26、步骤2-a：在60℃下保持600-1800秒；

27、步骤2-b：30秒内，将磁珠从第二列孔位转移到第三列孔位中，并混匀；

28、步骤3-a：保持120秒；

29、步骤3-b：30秒内，将磁珠从第三列孔位转移到第四列孔位中，并混匀；

30、步骤4-a：保持90秒；

31、步骤4-b：30秒内，将磁珠从第四列孔位转移到第五列孔位中，并混匀；

32、步骤5：在60℃下保持180-600秒；

33、步骤6：在30秒内，将磁珠从第五列孔位转移到第四列孔位中。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果为：细胞裂解与磁珠结合同步进行，有效缩短提取时间，提高了本技术磁珠法核酸提取试剂盒的效率；无需添加溶菌酶、以及异丙醇或无水乙醇。