一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法与流程

本发明涉及细胞分离培养，尤其涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法。

背景技术：

1、til全称肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes)，是肿瘤间质中的异质性淋巴细胞，包括t细胞及nk细胞等。大多数情况下以cd3+、cd8+和t细胞为主，是机体淋巴细胞侵入到肿瘤组织中，并对肿瘤起识别、抵抗和攻击作用的细胞群体。

2、肿瘤浸润淋巴细胞的分离是一项重要的实验技术，可以帮助科研人员研究肿瘤的免疫应答机制、治疗方法以及预后情况。通过分离肿瘤浸润淋巴细胞，可以更好地研究肿瘤微环境中的免疫细胞互动，为癌症的治疗提供更有效的策略。目前分离肿瘤浸润淋巴细胞的方法主要包括机械分离、化学分离和磁性分离等。

3、中国专利cn117683716a公开了一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，包括以下步骤：将肿瘤浸润淋巴细胞从肿瘤组织中释放，对释放的肿瘤浸润淋巴细胞进行扩增培养；其中，将肿瘤浸润淋巴细胞从肿瘤组织中释放之前还包括使用uw液储存运输所述肿瘤组织的步骤。在肿瘤浸润淋巴细胞从肿瘤组织中释放之前增加将所述肿瘤组织使用uw液储存运输的步骤，可以显著提升肿瘤浸润淋巴细胞扩增效率，从而获得更多的肿瘤浸润淋巴细胞。

4、但是现有技术中的分离培养方法得到的肿瘤浸润淋巴细胞数量和活性有待进一步提升。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，能够在短时间内获得更多数量的肿瘤浸润淋巴细胞。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、将肿瘤组织与消化液混合，进行消化处理，得到消化产物；

5、s2、将消化产物过滤、离心，得到沉淀细胞；

6、s3、将沉淀细胞重悬，得到细胞悬液；

7、s4、将细胞悬液与淋巴细胞分离液混合，离心后得到分层体系；

8、s5、收集所述分层体系中，分层界面上云雾状的细胞层，得到混合细胞；

9、s6、将混合细胞进行离心、洗涤，接种至x-vivo15培养基，培养12～36h，得到悬浮细胞，即为肿瘤浸润淋巴细胞；

10、s7、将所述肿瘤浸润淋巴细胞进行扩增培养。

11、优选的，所述细胞悬液与淋巴细胞分离液混合的体积比为1.5～2.5:1。

12、优选的，所述消化处理的时间为1～2h。

13、优选的，所述消化液中含有细胞培养基和混合酶。

14、优选的，所述混合酶包括dna酶、胶原酶和透明质酸酶。

15、优选的，所述消化液中dna酶的浓度为0.001～0.003％；

16、所述消化液中胶原酶的浓度为0.08～0.12％；

17、所述消化液中透明质酸酶的浓度为0.005～0.015％。

18、优选的，s2中，所述离心的转速为1500～2500r/min，所述离心的时间为10～30min；

19、和/或，s6中，所述离心的转速为1000～2000r/min，所述离心的时间为3～8min；

20、所述洗涤采用的洗涤剂为缓冲液和/或x-vivo15培养基；

21、s6中，所述接种的浓度为0.5×106～2×106个/ml。

22、优选的，所述扩增培养包括以下步骤：

23、s7.1、先在培养体系中补加ifn-y，培养0.5～2d；

24、s7.2、然后补加okt3和il-2，培养6～20h；

25、s7.3、最后补加含有il-2的完全培养基，培养10～20d。

26、优选的，s7.1中，所述ifn-y的终浓度为500～1500u/ml；

27、s7.2中，所述okt3的终浓度为50～150ng/ml；

28、所述il-2的终浓度为500～1500u/ml。

29、优选的，s7.3中，所述完全培养基中il-2的终浓度为500～1500u/ml。

30、本发明的有益效果：

31、本发明通过采用特定的分离方法，能够由肿瘤组织中成功得到更多数量的肿瘤浸润淋巴细胞，且所得的肿瘤浸润淋巴细胞具有优良的活性，对肿瘤细胞的杀伤率较高，既可作为肿瘤免疫反应的标记物，用于肿瘤进展与预后分析，也可作为过继性t细胞免疫疗法的(til疗法)细胞来源，具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞悬液与淋巴细胞分离液混合的体积比为1.5～2.5:1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述消化处理的时间为1～2h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述消化液中含有细胞培养基和混合酶。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述混合酶包括dna酶、胶原酶和透明质酸酶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述消化液中dna酶的浓度为0.001～0.003％；

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，s2中，所述离心的转速为1500～2500r/min，所述离心的时间为10～30min；

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述扩增培养包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，s7.1中，所述ifn-y的终浓度为500～1500u/ml；

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，s7.3中，所述完全培养基中il-2的终浓度为500～1500u/ml。

技术总结本发明提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法，属于细胞分离培养技术领域。本发明通过采用特定的分离方法，能够由肿瘤组织中成功得到更多数量的肿瘤浸润淋巴细胞，能够解决现有技术中分离培养方法得到的肿瘤浸润淋巴细胞数量和活性有待进一步提升的问题。本发明所得的肿瘤浸润淋巴细胞具有优良的活性，对肿瘤细胞的杀伤率较高，既可作为肿瘤免疫反应的标记物，用于肿瘤进展与预后分析，也可作为过继性T细胞免疫疗法的细胞来源，具有广泛的应用前景。技术研发人员：姜琦,赵小兵受保护的技术使用者：陕西北天生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4