一种用于检测HEK293细胞中iPSC残留的引物探针组合及其应用的制作方法

本发明涉及生物制品中多能干细胞残留检测，特别涉及用于检测hek293细胞中ipsc残留的引物探针组合及其应用。

背景技术：

1、诱导性多能干细胞（ipsc）是通过人为地将转录因子或者小分子组合导入细胞中，使细胞回到未分化状态，所得到的类似于胚胎干细胞（esc）的细胞类型。ipsc的来源十分广泛，人体几乎所有细胞均可被重编程为ipsc。ipsc能规避使用胚胎干细胞时的伦理问题，具有广阔的应用前景。因此，ipsc技术已广泛应用于基础研究、疾病模型以及药物筛选等方面，是个性化细胞治疗和再生医学研究的重要工具。

2、目前已有众多ipsc来源的细胞治疗产品进入临床试验环节，包括间充质干细胞、心肌细胞、多巴胺能神经前体细胞、视网膜色素上皮细胞、自然杀伤细胞等。各种肾脏疾病——遗传性肾病、急性肾病、慢性肾病，是影响人类身体健康的杀手，ipsc来源的肾细胞（或肾脏类器官）成为其潜在的治疗手段。然而，ipsc在实际应用中，由于其具有无限增殖的能力，所以在细胞治疗产品中残留的ipsc等未分化细胞会存在形成畸胎瘤的风险，威胁着治疗的成功和患者的生命健康，成为其临床转化的最大阻碍。因此需要开发出高效灵敏的检测ipsc残留细胞的方法，以此来确保ipsc来源细胞治疗产品的安全性和可靠性。

3、目前，常见的ipsc残留检测的方法主要有培养法、免疫荧光染色法、流式细胞术检测法和实时荧光定量pcr（qpcr）/数字pcr（ddpcr）。培养法主要是利用高效的培养技术，使单个残留的ipsc细胞形成边缘清晰的克隆，在高倍显微镜下观察时，与周围体细胞区别明显，通过对克隆进行计数即可确定ipsc残留细胞的比例。然而，培养法的周期太久，一般需要7-10天的检测时间；在培养的过程中有些细胞会自发分化，当细胞种植浓度过低时ipsc细胞不易存活，这都会导致假阴性结果。

4、免疫荧光染色法是根据抗原与抗体结合的反应原理，将细胞以合适的密度种植于培养板中，利用ipsc细胞的特异性抗体进行染色，从而对ipsc细胞进行定位。然而，当抗体的特异性不高时，会导致假阳性结果；当细胞种植密度过低时，容易导致假阴性结果。

5、流式细胞术检测法是利用流式细胞术，对ipsc残留细胞进行定量检测。为了去除与抗体非特异性结合的背景，对抗体的特异性要求较高，并且该方法的灵敏度交底，一般仅能达到1%左右。

6、实时荧光定量pcr（qpcr）或数字pcr（ddpcr）是通过检测ipsc细胞中特异性标志基因的表达，对表达量的差异进行判读，从而确定ipsc细胞残留量的比例。在目前已报道的ipsc残留细胞检测方法中，定量pcr具有操作简单、耗时短、灵敏度高的优势。并且随着数字pcr技术的发展，ipsc残留的最低检测限又得到了进一步的提高。然而，这两套方法操作复杂，对实验人员及实验室设备要求较高，无形中增加了检测成本，不利于ipsc残留检测的大规模应用。

7、hek293细胞是一种人肾上皮细胞系，来源于人胚胎肾细胞，是一个很常用的表达研究外源基因功能的工具细胞株。hek293细胞具有转染效率高，易于培养等特点，极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染。作为人胚肾细胞，hek293中的ipsc残留检测方法能为ipsc来源肾细胞中ipsc残留的检测提供重要参考。目前为止，基于实时荧光定量pcr或免疫荧光染色法，尚未发现更高灵敏度的针对人肾细胞hek293中ipsc残留的检测方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种用于检测hek293细胞中ipsc残留的引物探针组合及其应用，针对标志物sfrp2和zscan10基因片段，分别设计相应的检测引物和探针，提取样本中的细胞rna进行反转录，对cdna进行qpcr，利用检测引物采用染料法进行检测，结合检测引物和探针采用探针法进行检测，最终达到0.0001%的检测灵敏度。具体通过以下技术实现。

2、本发明的第一方面，提供了一种检测hek293细胞中ipsc残留的方法，包括步骤为：

3、提取待测样本中细胞的rna，对所述rna进行反转录，得到反转录产物cdna，对cdna进行qpcr扩增；

4、设计检测基因sfrp2的第一引物组合和第一探针，设计检测基因zscan10的第二引物组合和第二探针，设计检测内参基因gapdh的第三引物组合和第三探针；

5、利用第一引物组合和第一探针检测qpcr扩增产物中的基因sfrp2表达，或者利用第二引物组合和第二探针检测qpcr扩增产物中的基因zscan10的表达；利用第三引物组合和第三探针检测qpcr扩增产物中的内参基因gapdh的表达；

6、计算获得待测样本和hek293细胞标准品的中基因sfrp2或zscan10的表达量，以基因gapdh作为内参基因，比较待测样本与hek293细胞标准品的sfrp2或zscan10的表达差异，判断待测样本中ipsc的残留情况；

7、所述第一引物组合的第一正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，第一反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述第二引物组合的第二正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述第二反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述第三引物组合的第三正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述第三反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。

8、本发明的上述检测hek293细胞中ipsc残留的方法中，针对基因sfrp2或zscan10，设计了相应的引物组合（正、反向引物）和探针。通过qpcr扩增法获得待测样本中基因sfrp2或zscan10的扩增曲线和ct值，并通过比较ct值确定hek293细胞中的ipsc残留量。当利用染料法时，只需采用引物组合即可；当利用探针法时，还需要使用探针。

9、容易知晓的是，探针的核苷酸序列的5’段连接了荧光基团，3’连接了淬灭基团。

10、荧光基团和淬灭基团均为本领域常用基团。可选地，荧光基团可选择但不限于fam、tet、ned、rox、cy3、cy5、vic、joe、hex、texas red或lc red460。淬灭基团可选择但不限于mgb、tamra、nfq、eclipse、dabcyl、bhq1或bhq2。

11、进一步地，采用染料法检测时，利用所述第一引物组合检测sfrp2基因的表达，或者利用所述第二引物组合检测基因zscan10的表达；利用所述第三引物组合检测内参基因gapdh的表达；

12、采用探针法检测时，利用所述第一引物组合和第一探针检测基因sfrp2的表达，或者利用所述第二引物组合和第二探针检测基因zscan10的表达；利用所述第三引物组合和第三探针检测内参基因gapdh的表达；所述第一探针的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述第二探针的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述第三探针的核苷酸序列如seq id no.9所示。

13、更进一步地采用染料法检测时，以hek293细胞标准品作为对照样本，用δδct的方法进行计算，计算公式为δct=ct基因标志物–ct内参，δδct=δct待测样本–δct对照样本，相对表达量=2(-δδct)；根据待测样本与hek293细胞标准品的sfrp2或zscan10的相对表达量的显著性关系，判断ipsc残留。

14、本发明的第二方面，提供了一种用于检测hek293细胞中ipsc残留的系统，包括用于检测sfrp2基因的第一引物组合，或者用于检测zscan10基因的第二引物组合；所述系统还包括检测内参基因gapdh的第三引物组合；

15、所述第一引物组合的第一正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，第一反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述第二引物组合的第二正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述第二反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述第三引物组合的第三正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述第三反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。

16、进一步地，上述系统中还包括用于检测内参基因gapdh的第三探针；

17、当所述系统含有第一引物组合时，还包括第一探针；当所述系统含有第二引物组合时，还包括第二探针；所述第一探针的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述第二探针的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述第三探针的核苷酸序列如seq id no.9所示。

18、本发明的第三方面，还提供了一种上述系统在检测hek293细胞中ipsc残留中的应用用途。

19、本发明的第四方面，还提供了一种用于检测hek293细胞中ipsc残留的产品，包括上述系统。

20、进一步地，上述产品为检测试剂盒、检测试纸条或检测芯片。

21、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

22、1、本发明提供了利用标志物基因sfrp2、zscan10新的应用，即用于检测hek293细胞中的ipsc残留。与常用cnmd、ido1、lin28、htert、oct4、sox2、nanog等标志物相比，其梯度样本区分更明显，检测灵敏度更高。

23、2、通过检测标志物基因sfrp2、zscan10在ipsc中的表达，能区分出1×106个293细胞中含有的1个ipsc残留，即达到0.0001%的检测灵敏度，相比于同类型方法更为灵敏。