一种蜘蛛毒液来源的重组透明质酸酶、酵母工程菌及构建方法与应用与流程

本发明属于基因工程，具体涉及一种蜘蛛毒液来源的重组透明质酸酶、酵母工程菌及构建方法与应用。

背景技术：

1、透明质酸，(hyaluronan或hyaluronic acid,ha)又叫玻尿酸，是一种天然存在于生物体内的糖胺聚糖，由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的。

2、透明质酸酶，作为一种能够降解透明质酸的酶，在医药、化妆品以及生物技术等多个领域都有着广泛的应用。

3、从国际视角来看，欧美等发达国家在透明质酸酶的生物制备领域起步较早，且积累了丰富的经验和技术。这些国家的研究机构和企业注重基础研究和创新，通过基因工程、细胞培养等手段，不断优化透明质酸酶的制备工艺，提高酶的活性和稳定性。同时，他们还积极探索透明质酸酶在医疗领域的新应用，如肿瘤治疗、关节炎治疗等，为人类的健康事业做出了重要贡献。

4、国内在透明质酸酶的生物制备研究方面虽然起步较晚，但近年来也取得了长足的进步。国内的科研机构和企业加大了对透明质酸酶研究的投入，通过引进国外先进技术、培养专业人才、加强国际合作等方式，不断提升自身的研发实力。

5、在应用方面，透明质酸酶在医药领域的应用日益广泛。它不仅可以用于制备透明质酸类药物，还可以作为辅助治疗手段，用于改善关节炎、肿瘤等疾病的症状。此外，在化妆品领域，透明质酸酶也被广泛用于制备具有保湿、抗衰老等功效的化妆品。

6、工业生产需求对透明质酸酶的需求仍十分巨大，为实现透明质酸酶的工业化前景，市场对透明质酸酶的种类丰富度有了更高的期待。且通过毕赤酵母生产的透明质酸酶具有一定的价格和纯度优势，且酵母在医药、美容、食品等多重领域的认可度较高，更易被消费者接受。

7、在制备方法上，国内外研究者主要采用了基因工程技术和发酵工程技术。通过克隆透明质酸酶基因并将其导入合适的宿主细胞，可以实现透明质酸酶的高效表达。中国专利cn200810134513.6利用大肠杆菌表达获得具有酶活性的透明质酸酶蛋白，但表达产物位于菌体内，导致分离纯化工艺复杂，影响产量且增加了成本和污染风险；中国专利cn201410555212.6利用枯草芽孢杆菌进行透明质酸酶的制备，但枯草芽孢杆菌表达的拷贝数通常较少，相比酵母而言表达量更低，存在转化困难、遗传操作复杂等缺点。

8、虽然已有利用毕赤酵母制备透明质酸水解酶的成功案例报道(cn201310597818.1和cn202110245290.6)，目前通过毕赤酵母工程菌表达利用的透明质酸酶，主要是水蛭、山大齿猛蚁来源的，所被探索的透明质酸酶的种类也较为稀少，专利cn114350639a中虽有提及棕色蜘蛛来源的透明质酸酶，但该篇专利中棕色蜘蛛来源的透明质酸酶未获酶活，且无法成功降解透明质酸。另外，有关透明质酸酶工业化生产和应用的报道也相对稀缺。

9、现有技术中关于蛋白重组的方式多种多样，不同的重组方式对于同种蛋白酶的影响无法预期，相同的重组方式对于不同蛋白酶的影响也无法预期。

10、目前尚未见报道利用棕色蜘蛛毒液来源的透明质酸酶基因在酵母中成功表达生产透明质酸酶。因此，本发明旨在解决这一技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种蜘蛛毒液来源的重组透明质酸酶、酵母工程菌及构建方法与应用。

2、本发明首次利用酵母菌成功表达了棕色蜘蛛毒液来源的透明质酸酶(序列号为r4j7z9.1)，为实际应用增加了透明质酸酶的多样性，本发明提供的棕色蜘蛛毒液来源的重组透明质酸酶在酵母菌中能够有效表达，利用本发明提供的构建方法制备的酵母工程菌摇瓶发酵培养阶段的透明质酸酶的酶活达51982u/ml。

3、本发明首次发现棕色蜘蛛毒液来源的透明质酸酶(序列号为r4j7z9.1)能够水解透明质酸的β-1，3糖苷键，产物的还原端为udp-葡萄糖醛酸，属于第二类透明质酸酶；能降解透明质酸。

4、本发明提供一种新型的透明质酸酶生产方式，为透明质酸酶的工业化生产提供新的途径和思路。

5、本发明的技术方案如下：

6、一种重组透明质酸酶，所述重组透明质酸酶氨基酸序列如seq id no.5所示。

7、上述重组透明质酸酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。

8、一种重组透明质酸酶，在上述重组透明质酸酶的氨基酸序列seq id no.5上插入6×his标签和sumo标签，所述重组透明质酸酶的氨基酸序列如seq id no.16所示。

9、上述重组透明质酸酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.17所示。

10、一种重组载体，包含上述重组透明质酸酶的编码基因seq id no.6或seq idno.17。

11、一种重组菌，包含上述重组透明质酸酶的编码基因seq id no.6或seq id no.17。

12、一种酵母工程菌，所述酵母工程菌为在酵母菌中导入上述重组透明质酸酶的编码基因seq id no.6或seq id no.17。

13、根据本发明优选的，所述酵母菌为毕赤酵母。

14、进一步优选的，所述毕赤酵母为p.pastoris gs115。

15、根据本发明优选的，构建酵母工程菌时，使用ppic9k载体，ppic9k载体中的信号肽α-factor替换为sp23信号肽，所述信号肽α-factor的核苷酸序列如seq id no.19所示；sp23信号肽的核苷酸序列如seq id no.7。

16、上述酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

17、(1)将透明质酸酶蛋白的编码基因序列seq id no.6以同源重组的手段插入至ppic9k载体中的ecori和noti酶切位点之间，得到重组质粒ppic9k-haase-loxin-2；

18、(2)利用pcr的手段在步骤(1)得到的重组质粒ppic9k-haase-loxin-2中核苷酸序列seq id no.6的n端插入6×his标签，c端插入sumo标签；并将重组质粒ppic9k-haase-loxin-2中α-factor信号肽替换为sp23信号肽，得到重组质粒载体ppic9k-haase-loxin-3；

19、所述6×his标签的核苷酸序列如seq id no.10所示；

20、所述sumo标签的核苷酸序列如seq id no.13所示；

21、所述信号肽α-factor的核苷酸序列如seq id no.19所示；

22、所述sp23信号肽的核苷酸序列如seq id no.7所示；

23、(3)使用限制性内切酶sali对步骤(2)得到的重组质粒ppic9k-haase-loxin-3进行线性化处理，得到线性化片段，并转化入毕赤酵母感受态细胞，筛选获得重组透明质酸酶融合蛋白基因的工程菌p.pastoris/ppic9k-haase-loxin-3；

24、或者上述酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：

25、将pcr得到的sp23信号肽基因与bamh i和ecori双酶切后的ppic9k同源重组克隆到毕赤酵母表达载体中，并以此为模板选用ecori和noti作为酶切位点将seq id no.17核苷酸序列通过无缝克隆试剂盒进行同源重组，得到ppic9k-haase-loxin-3，而后转化至e.coil dh5α中，并进行质粒提取后，选取限制性内切酶sali对重组质粒进行线性化，对其产物进行纯化后，以电转化的手段转化至制备的毕赤酵母表达宿主感受态细胞中，筛选获得重组透明质酸酶融合蛋基因的工程菌p.pastoris/ppic9k-haase-loxin-3。

26、根据本发明优选的，所述构建方法中，毕赤酵母为p.pastoris gs115。

27、一种pichia pastoris haase-loxin-9k-gs115，已于2024年6月19号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号cctcc no：m 20241298。

28、上述重组透明质酸酶的编码基因、重组载体、重组菌、酵母工程菌或pichiapastoris haase-loxin-9k-gs115在降解透明质酸中的应用。

29、上述重组透明质酸酶的编码基因、重组载体、重组菌、酵母工程菌或pichiapastoris haase-loxin-9k-gs115在生产透明质酸寡糖中的应用。

30、上述重组透明质酸酶的编码基因seq id no.6、重组载体、重组菌或酵母工程菌在制备重组透明质酸酶中的应用，所述重组透明质酸酶氨基酸序列如seq id no.5所示。

31、上述重组透明质酸酶的编码基因seq id no.17、重组载体、重组菌、酵母工程菌或pichia pastoris haase-loxin-9k-gs115在制备重组透明质酸酶中的应用，所述重组透明质酸酶氨基酸序列如seq id no.16所示。

32、本发明的有益效果至少包括如下内容：

33、1、本发明首次利用酵母菌成功表达了棕色蜘蛛毒液来源的重组透明质酸酶，为实际应用增加了透明质酸酶的多样性，提高市场竞争力。

34、2、本发明提供的棕色蜘蛛毒液来源的重组透明质酸酶在酵母菌中能够有效表达；本发明提供的构建方法制备的酵母工程菌摇瓶发酵培养阶段的透明质酸酶的酶活达51982u/ml，相较于原始序列透明质酸酶蛋白表达量提升明显，更适应于大规模工业化生产的需求，同时在实际应用中，该重组蛋白可以有效降解大分子透明质酸。

35、3、本发明提供的酵母菌株构建及表达方法操作简单，不需要复杂的设备和技术，稳定性好，降低了工厂化应用的成本，易于在工业生产中推广应用；为透明质酸酶的工业化生产提供了新的、高效的途径。

36、4、由于透明质酸酶在医药、化妆品以及生物技术等多个领域具有广泛的应用，因此本发明的方法不仅具有巨大的商业价值，还有助于推动相关领域的科技进步。