一种适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体及其应用

本发明涉及生物医药基因工程领域，具体涉及一种适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体以及应用。

背景技术：

1、最近几年，基因工程益生菌引起了人们的高度重视。由于益生菌在改善胃肠道功能，提高机体免疫力方面的突出功用，人们自然想到利用现代基因工程技术，以益生菌为宿主菌表达一些特定功能的重组蛋白或多肽来预防和治疗疾病。有的利用益生菌表达尼生素、片球菌素等抗菌肽，用于抑制致病菌生长，防治细菌感染疾病；有的用于表达抗炎因子（如白细胞介素10，il-10），或粘膜保护因子（如三叶因子trefoil factor），用于治疗胃炎和炎症性肠病；有的用于制备轮状病毒、破伤风毒素c、沙门氏菌等口服疫苗；有的用作基因治疗的载体，用于恶性肿瘤等疾病的治疗。例如，有人用基因工程双歧杆菌表达内皮抑素，应用于抗肿瘤治疗。该研究已申请发明专利，进入临床试验。有人用双歧杆菌表达胞嘧啶脱氨酶（cd）基因作为载体，注射到实体瘤局部，表达分泌的cd可将低毒性的化疗药物5-氟胞嘧啶（5-fc）催化生成细胞毒性较强的5-氟脲嘧啶（5-fu），既增强了化疗药物的疗效，又降低了毒副作用。有的用重组乳酸菌表达cd47纳米抗体，以提高机体的主动抗肿瘤免疫力。益生菌诱导表达载体既适用于表达分泌能通过胃肠道上皮吸收发挥全身作用的重组蛋白，也适用于表达可直接在胃肠道内发挥功能作用的重组蛋白。抗菌肽、三叶因子等就可在胃肠道内抑制致病菌生长，修复黏膜损伤；有些酶和营养因子可促进益生菌生长，或帮助食物消化分解，或促进营养的转换和吸收；有些重组蛋白，如肠肽激素、细胞因子、免疫因子等，可直接作用于胃肠道上皮细胞上的受体，通过与相应受体的相互作用而发挥生物学作用。可见，益生菌诱导表达载体的应用前景非常广阔。

2、但是，目前没有合适的在胃肠道内诱导表达外源基因的益生菌表达调控系统。基因工程领域现有的乳糖操纵子、色氨酸操纵子、温度敏感操纵子和乳酸链球菌素（nisin）操纵子等基因表达调控模式不适用于基因工程益生菌，尤其不适合在肠腔内诱导表达重组蛋白。乳糖操纵子所用的诱导剂异丙基-b-d-硫代半苏糖苷(iptg)是人工合成的糖苷，对人体有毒，只能作为体外的诱导剂，不能用作体内诱导剂。色氨酸操纵子的诱导剂色氨酸虽能口服，但口服后易在上消化道被消化分解，到达肠道的量太少，达不到诱导基因表达的浓度。温度敏感操纵子更无法应用于体内，要在体内操控温度，更不切实际。nisin操纵子只存在于乳球菌、链球菌中，并且nisin是一种抑菌肽，会抑制其他细菌生长。因此，nisin操纵子只适合在乳球菌中诱导外源基因表达，不适合在其他益生菌中调控基因表达，适用范围小。

3、用阿拉伯糖操纵子基因调控表达系统，利用基因工程双歧杆菌表达胃泌酸调节素等肠肽激素，干扰素α、胸腺肽α等免疫因子，肿瘤抑素（tumorstatin）等抗肿瘤药物，在体外和动物实验中均获得了较好的疗效。但是，阿拉伯糖操纵子基因调控表达系统来源于大肠杆菌，也存在以下缺点：（1）在基因工程大肠杆菌中表达效率高，但在基因工程益生菌中的表达效率低；（2）表达效率受到葡萄糖抑制，而葡萄糖既是体外培养基的主要碳源，又是淀粉的主要消化产物，在肠腔中的浓度也较高，致使阿拉伯糖操纵子基因调控表达系统在体外和体内的表达水平都受到抑制。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体，该表达载体能以乳酸乳球菌为宿主菌，以低聚木糖或木聚糖为诱导剂在肠腔内或体外诱导外源目的基因表达和分泌。

2、本发明的第二个目的是提供一种适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体在在制备生物药品或食品中的应用。

3、本发明的第一个目的通过如下技术方案实现：

4、一种适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体，利用双歧杆菌的胞外外切木聚糖酶ecx基因的启动子和分泌性信号肽控制外源基因的表达和分泌，能以乳酸乳球菌为宿主菌，以低聚木糖或木聚糖为诱导剂在肠腔内或体外诱导外源目的基因表达和分泌。

5、进一步地，所述表达载体的构建方法是以双歧杆菌ncc20075基因组dna为模板，pcr扩增ecx基因的启动子和分泌性信号肽dna序列片段；将ecx基因启动子和分泌性信号肽dna片段插入到乳酸乳球菌表达载体pnz8149多克隆位点上游，置换pnz8149载体中原有的nisin启动子（pnisin）dna序列，获得plxs表达载体；

6、ecx基因启动子和分泌性信号肽dna片段的核苷酸序列如seq id no.3和seq idno.4所示。

7、进一步地，所述表达载体的构建方法是：

8、（1）根据长双歧杆菌ncc2705胞外外切木聚糖酶ecx基因的启动子（pecx）和分泌性信号肽（specx）dna碱基序列，设计并合成一对引物，并在上游引物expf1的5’端引入核酸内切酶bamhⅰ酶切序列，在下游引物expr1的5’端引入内切酶ncoⅰ酶切序列。所述的上游引物ecxf1序列和下游引物ecxr1核酸序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示。

9、（2）以提取的长双歧杆菌ncc2705基因组dna为模板，用expf1和expr1引物pcr扩增ecx启动子pecx和信号肽specx dna片段，纯化回收pecx-specx dna片段。

10、（3）回收的pecx-specx dna片段用内切酶bamhⅰ和ncoⅰ酶切消化，和表达载体pnz8149用内切酶psuⅰ和ncoⅰ酶切消化，切除pnz8149中pnisin dna片段，凝胶回收pecx-specx 片段和pnz8149载体大片段；将pecx—specx片段和pnz8149载体酶切片段按5：1比例混合，用t4dna连接酶将二者连接起来，电转化方法转化到lacf基因缺失的乳酸乳球菌中，用采用以乳糖为唯一碳源的选择培养基筛选获得plxs重组表达载体转化乳酸乳球菌。

11、（4）提取质粒dna，采用内切酶酶切和dna测序鉴定pecx-specx片段成功替换pnisin，并且序列正确的重组plxs表达载体。提取plxs质粒dna备用。

12、进一步地，步骤（2）中所述的ecx信号肽为片球菌k1信号肽、乳球菌非结构性蛋白信号肽、或双歧杆菌α淀粉酶信号肽。

13、进一步地，所述乳酸乳球菌表达载体pnz8149为nisin诱导表达系统nice，由nisin启动子pnisin控制基因表达，含lacf乳糖营养缺陷补偿基因，不含抗生素耐药基因。

14、进一步地，所述选择培养基是乳糖为唯一碳源的em培养基，其中乳糖的含量为0.5%~2.0%（w/v）。

15、本发明的第二个目的是适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体在制备生物药品或食品中的应用，具体通过如下技术方案实现：

16、在适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体中插入外源目的基因，电转化宿主菌获得基因转化工程菌，将基因转化工程菌制备成生物药品或食品。

17、进一步地，所述外源目的基因包括但不限于绿色荧光蛋白、长效胰高血糖素样肽、类似肽、和exendin-4。

18、进一步地，所述电转化的电击条件为：电压1.6kv~2.5kv，电容20~25µf，电阻200~300ω。

19、进一步地，体外培养发酵基因转化工程菌制备成活菌制剂，与诱导剂低聚木糖或木聚糖一起口服，可在肠腔内诱导重组多肽或重组蛋白表达分泌，达到防治疾病的目的。

20、具体地，可用大肠杆菌分泌性信号肽gⅲ序列替换plxs表达载体中的ecxs信号肽序列，在ncoⅰ和xbaⅰ多克隆位点插入外源基因获得携带外源基因的重组表达载体，常规化学转化法获得基因转化大肠杆菌工程菌，在体外或肠腔内用低聚木糖诱导重组多肽或重组蛋白表达分泌，最后将基因转化大肠杆菌制备成活菌制剂。

21、进一步地，用低聚木糖或木聚糖作为诱导剂，在体外诱导重组多肽或重组蛋白的表达分泌，最后将培养上清中重组多肽或重组蛋白浓缩或纯化后制备成食品或口服药品。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

23、（1 ）本发明的适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体既适合在体外诱导外源基因表达，也适合在肠腔内诱导外源基因表达。诱导剂低聚木糖或木聚糖在膳食纤维中含量较高，不能被上消化道和普通细菌消化分解，只能被部分益生菌分解利用，并有刺激益生菌增殖的作用。低聚木糖或木聚糖口服后不易在上消化道消化吸收，在肠腔内能维持较高的浓度，保证了其诱导外源基因表达的效率，并且有非常高的食用安全性。

24、（2）本发明的适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体，不添加诱导剂低聚木糖或木聚糖时，外源基因只有很低水平表达。添加诱导剂低聚木糖或木聚糖等能在体外或肠腔内高效诱导外源目的基因表达。

25、（3）本发明的适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体还能以益生菌等革兰氏阳性细菌为宿主菌，也能以大肠杆菌等革兰氏阴性细菌为宿主菌；既适合于体外诱导外源基因表达，也适合于体内（肠腔内）诱导外源基因表达；适用于表达各种细胞因子、免疫因子、特殊的蛋白和酶，多肽类激素，重组蛋白，抗原蛋白，可用于制备益生菌活菌药物和口服疫苗，用于营养缺乏、遗传缺陷性疾病的补偿性治疗，感染性疾病治疗，恶性肿瘤的基因治疗，还可应用于家禽、家畜益生菌饲料添加剂的生产和疾病防治。

26、（4）本发明的适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体，进一步获得基因转化工程菌可制备成活菌悬液、乳制品、活菌菌粉、菌片或胶囊等活菌制剂，口服后能在人体肠道内增殖和定植，同时食用低聚木糖或木聚糖可诱导外源功能基因表达，达到促进身体健康，预防和治疗疾病的目的。

27、（5）本发明的适合肠腔内诱导表达的乳酸乳球菌表达载体，基因转化乳酸乳球菌除了表达分泌的重组多肽或重组蛋白有特定的功能作用外，乳酸乳球菌本身具有调节胃肠道菌群平衡，改善胃肠道功能的作用；诱导剂低聚木糖或木聚糖不仅能诱导外源基因表达，还兼有促进益生菌生长增殖、润肠通便、降脂减肥等有益作用，与基因转化工程菌在促进健康、防治疾病方面有协同作用。