生产乳糖-N-四糖的基因工程菌及其制备方法与应用与流程

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种生产乳糖-n-四糖的基因工程菌及其制备方法与应用。

背景技术：

1、人乳寡糖(hmo)是一组结构多样的非共轭聚糖，在母乳中的含量仅次于乳糖和脂类，属于第三大营养物质，其中乳糖-n-四糖(lnt)是hmo的核心结构，占总hmo的6％(w/w)。此外，lnt作为岩藻糖基化和唾液酸化的核心结构，其岩藻糖基化和/或唾液酸化衍生物占总hmo的30％以上(w/w)。因此，lnt的合成是多种hmo合成的关键。

2、研究表明，lnt具有提高肠道益生菌丰度、预防病原体黏附、增强肠道屏障、免疫调节、抗病毒等作用。随着lnt作为母乳生物活性成分的生物学价值不断被证实，其已被不同国家和地区批准作为新食品原料添加到婴儿奶粉等食品中，具有较高的商业价值。

3、目前实现lnt大规模生产的主要方法是代谢工程菌的微生物合成发酵法，合成过程主要包括使用β-1,3-n-乙酰葡糖胺转移酶催化udp-glcnac和乳糖合成乳糖-n-三糖，然后乳糖-n-三糖在β-1,3-半乳糖基转移酶的作用下和udp-gal生成lnt。但在实际发酵过程中，具有四糖结构的lnt很难被细菌细胞从胞内转出到胞外培养基中，随着发酵时间的延长，lnt胞内积累会导致细胞胀破、发酵提前终止，限制产量增加的同时也造成了下游产物的分离纯化困难等问题。而目前关于lnt细胞外排的研究报道较少，因此需要寻求合适的方式方法来促进lnt细胞外排。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种能够高效转运乳糖-n-四糖的基因工程菌株。

3、用于解决问题的方案

4、本发明提供了一种生产乳糖-n-四糖的基因工程菌，所述基因工程菌过表达外源转运蛋白基因bmset。

5、优选地，所述bmset来源于巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)。

6、优选地，所述bmset的氨基酸序列与seq id no.4相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

7、优选地，所述bmset的氨基酸序列如seq id no.4所示。

8、优选地，所述基因工程菌还表达了外源β-1,3-n-乙酰葡糖胺转移酶基因lgta、外源β-1,3-半乳糖基转移酶基因wcf和外源尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶基因gale。

9、优选地，所述lgta来源于脑膜炎奈瑟球菌(neisseria meningitidis)，所述wcf来源于弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)，所述gale来源于大肠杆菌(escherichiacoli)。

10、优选地，所述lgta的氨基酸序列与seq id no.1相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选地，所述lgta的氨基酸序列如seq id no.1所示；

11、优选地，所述wcf的氨基酸序列与seq id no.2相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选地，所述wcf的氨基酸序列如seq id no.2所示；

12、优选地，所述gale的氨基酸序列与seq id no.3相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选地，所述gale的氨基酸序列如seq id no.3所示。

13、本发明还提供了一种制备所述的基因工程菌的方法，所述方法包括如下步骤：

14、(1)构建表达所述lgta、wcf和gale的质粒；

15、(2)以大肠杆菌出发菌株，将所述表达lgta、wcf和gale的质粒引入所述出发菌株，构建底盘菌株；

16、(3)构建表达所述bmset的质粒；

17、(4)将所述表达bmset的质粒引入所述底盘菌株，构建所述基因工程菌。

18、本发明还提供了一种生物制剂，所述生物制剂包括所述的基因工程菌。

19、本发明还提供了一种所述的基因工程菌、或所述的生物制剂在生产乳糖-n-四糖中的应用。

20、本发明还提供了一种生产乳糖-n-四糖的方法，所述方法以葡萄糖为碳源，以乳糖为底物，利用所述的基因工程菌、或所述的生物制剂发酵生产乳糖-n-四糖。

21、发明的效果

22、本发明的基因工程菌能够使乳糖-n-四糖快速高效地排出胞外，促进乳糖-n-四糖发酵产量的提升，同时提高胞外培养基中乳糖-n-四糖浓度，具有良好的工业化应用前景。

技术特征：

1.一种生产乳糖-n-四糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达外源转运蛋白基因bmset。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述bmset来源于巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述bmset的氨基酸序列与seq idno.4相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还表达了外源β-1,3-n-乙酰葡糖胺转移酶基因lgta、外源β-1,3-半乳糖基转移酶基因wcf和外源尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向异构酶基因gale。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述lgta来源于脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)，所述wcf来源于弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)，所述gale来源于大肠杆菌(escherichia coli)。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述lgta的氨基酸序列与seq idno.1相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选地，所述lgta的氨基酸序列如seq id no.1所示；

7.一种制备根据权利要求1-6中任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

8.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包括根据权利要求1-6中任一项所述的基因工程菌。

9.一种根据权利要求1-6中任一项所述的基因工程菌、或根据权利要求8所述的生物制剂在生产乳糖-n-四糖中的应用。

10.一种生产乳糖-n-四糖的方法，其特征在于，所述方法以葡萄糖为碳源，以乳糖为底物，利用根据权利要求1-6中任一项所述的基因工程菌、或根据权利要求8所述的生物制剂发酵生产乳糖-n-四糖。

技术总结本发明涉及一种生产乳糖‑N‑四糖的基因工程菌及其制备方法与应用，所述基因工程菌过表达外源转运蛋白基因BmSet。本发明的基因工程菌能够使乳糖‑N‑四糖快速高效地排出胞外，促进乳糖‑N‑四糖发酵产量的提升，同时提高胞外培养基中乳糖‑N‑四糖浓度，具有良好的工业化应用前景。技术研发人员：刘振云,张璇,席海燕,孟丹丹受保护的技术使用者：苏州一兮生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/17