生产RNA的方法与流程

发明领域本发明涉及通过使用微生物发酵生产rna(核糖核酸)的方法。

背景技术：

0、发明背景

1、作为通过使用微生物生产rna的方法，已知例如使用缺乏核糖核酸酶iii(rna酶iii)的大肠杆菌(escherichia coli)作为宿主在细菌细胞中积累rna的方法(非专利文献1)、与phi 6噬菌体的功能组合使用丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)作为宿主以在壳体中积累rna的方法(非专利文献2)、使用大肠杆菌作为宿主在细菌细胞中积累与trna的部分序列融合的rna的方法(非专利文献3)、使用大肠杆菌作为宿主在允许sirna与结合sirna的蛋白质形成复合物的情况下生产sirna的方法(非专利文献4)、使用小红卵菌属(rhodovulum)的细菌作为宿主以通过分泌产生来生产rna的方法(专利文献1)、以及使用酵母作为宿主在酵母线粒体中积累rna的方法(专利文献2)。

2、引用表

3、专利文献

4、ptl 1：专利文献1：wo2009/063969

5、ptl 2：专利文献2：wo2010/084371

6、非专利文献

7、npl 1：非专利文献1：tenllado f,et.al.,crude extracts of bacteriallyexpressed dsrna can be used to protect plants against virus infections.bmcbiotechnol.2003mar 20；3:3.

8、npl 2：非专利文献2：aalto ap,et.al.,large-scale production of dsrna andsirna pools for rna interference utilizing bacteriophage phi6 rna-dependentrna polymerase.rna.2007mar；13(3):422-9.

9、npl 3：非专利文献3：ponchon l,et.al.,a generic protocol for theexpression and purification of recombinant rna in escherichia coli using atrna scaffold.nat protoc.2009；4(6):947-59.

10、npl 4：非专利文献4：huang l,et.al.,efficient and specific geneknockdown by small interfering rnas produced in bacteria.natbiotechnol.2013apr；31(4):350-6.

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明的一个目的是提供一种有效生产rna的方法。

2、本发明的发明人发现，通过使用缺乏核糖核酸酶iii(rna酶iii)的棒状杆菌细菌作为宿主，可以有效地生产rna，从而完成了本发明。

3、因此，本发明可以例如如下实施。

4、[1].一种生产目标rna的方法，所述方法包括：

5、在培养基中培养具有所述目标rna的表达单元的棒状杆菌细菌(coryneformbacterium)，以表达所述目标rna并在所述细菌的细胞中积累所述目标rna；并且

6、从所述细胞中收集所述目标rna，

7、其中所述细菌已经被修饰而使得与未经修饰的菌株相比核糖核酸酶iii的活性降低。

8、[2].上述方法，其中所述核糖核酸酶iii是下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质：

9、(a)包含seq id no:52的氨基酸序列的蛋白质；

10、(b)包含seq id no:52的氨基酸序列，且该氨基酸序列包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有核糖核酸酶iii活性的蛋白质；

11、(c)包含与seq id no:52的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有核糖核酸酶iii活性的蛋白质。

12、[3].上述方法，其中通过减弱编码核糖核酸酶iii的基因的表达或通过破坏所述基因来降低核糖核酸酶iii的活性。

13、[4].上述方法，其中通过缺失编码核糖核酸酶iii的基因来降低核糖核酸酶iii的活性。

14、[5].上述方法，其中所述细菌具有拷贝数为5个拷贝/细胞或更多的所述表达单元。

15、[6].上述方法，其中所述细菌具有拷贝数为70个拷贝/细胞或更多的所述表达单元。

16、[7].上述方法，其中所述细菌具有含有所述表达单元的载体。

17、[8].上述方法，其中所述表达单元在5’至3’的方向上含有在所述棒状杆菌细菌中起作用的启动子序列和编码所述目标rna的核苷酸序列。

18、[9].上述方法，其中所述启动子序列是源自噬菌体的启动子。

19、[10].上述方法，其中所述启动子序列是f1启动子或t7启动子。

20、[11].上述方法，其中所述启动子序列是下述(a)或(b)中定义的启动子：

21、(a)包含seq id no:13或78的核苷酸序列的启动子；

22、(b)包含与seq id no:13或78的核苷酸序列显示90％或更高的同一性的核苷酸序列的启动子。

23、[12].上述方法，其中所述细菌是属于棒杆菌属的细菌。

24、[13].上述方法，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。

技术特征：

1.一种生产目标rna的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核糖核酸酶iii是包含seq id no:52的氨基酸序列的蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过减弱编码核糖核酸酶iii的基因的表达或通过破坏所述基因来降低核糖核酸酶iii的活性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中通过缺失编码核糖核酸酶iii的基因来降低核糖核酸酶iii的活性。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌具有拷贝数为5个拷贝/细胞或更多的所述表达单元。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细菌具有拷贝数为70个拷贝/细胞或更多的所述表达单元。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述表达单元在5’至3’的方向上含有在所述棒状杆菌细菌中起作用的启动子序列和编码所述目标rna的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述启动子序列是源自噬菌体的启动子。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述启动子序列是f1启动子或t7启动子。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述启动子序列是包含seq id no:13或78的核苷酸序列的启动子。

技术总结提供了一种生产RNA的方法。通过在培养基中培养具有目标RNA的表达单元的棒状杆菌细菌以表达所述目标RNA并且在所述细菌细胞中积累所述目标RNA，并且从所述细胞中收集所述目标RNA来生产目标RNA，所述棒状杆菌细菌已经被修饰而使得核糖核酸酶III的活性降低。技术研发人员：羽城周平,安枝寿,三桥麻由,S·V·马什科,A·A·科耶洛夫,Y·S·洛巴诺娃受保护的技术使用者：味之素株式会社技术研发日：技术公布日：2024/10/17