一种调控豆科植物根瘤共生固氮的基因CTSH及其应用

本发明属于生物技术和植物学领域，具体地涉及一种调控豆科植物根瘤共生固氮的基因ctsh及其应用。

背景技术：

1、氮是植物生长发育必需的大量元素也是限制粮食产量的因素之一，氮素的缺失会造成农业减产。氮肥的施用革命性地提高了农作物的产量，极大地促进了粮食生产。但是，目前农作物化肥利用率普遍偏低。氮肥的低效利用不仅造成巨大的经济损失，而且还带来严重的水污染和土壤酸化等问题，对生态环境造成严重的破坏。空气中氮气是自然界中氮素的主要存在形式。但是植物不能直接利用空气中的氮气，只能利用氨态氮或者硝态氮，将这些无机氮转化成植物体内的氨基酸、核苷酸等有机氮。动物则直接或间接以植物为食物，吸收植物体内的有机氮同化成自身体内的有机氮。将大气中的具有三个高能键的氮气还原成氨的过程称为固氮作用。生物固氮，是通过微生物将氮气转换成氨的过程，也是最主要的固氮方式。能够进行生物固氮的微生物称为固氮菌，只有共生时才能固氮或高效固氮的固氮菌称为共生固氮菌。根瘤菌与豆科植物、根瘤菌与非豆科植物、放线菌与放线菌结瘤植物的共生固氮体系都可以形成根瘤，统称为根瘤共生固氮(root nodule symbiosis,rns)。

2、人类中有15种组织蛋白酶(cathepsin)，包含11种半胱氨酸蛋白酶(cysteineprotease)(cathepsin b,c,f,h,k,l,o,s,v,x和w)；2种丝氨酸蛋白酶(serine protease)(cathepsin a和g)和2种天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteases)(cathepsin e和d)[1]。其中半胱氨酸蛋白酶在豆科根瘤的发育的多个过程中发挥重要作用。例如，豌豆中半胱氨酸蛋白酶基因pscyp1[2]、紫云英中根瘤特异的半胱氨酸蛋白酶基因asnodf32[3,4]、大豆中根瘤特异的一类c13家族cd类型的半胱氨酸蛋白酶gmcysp1[5]在根瘤的衰老组织中表达、苜蓿中两种不同类别的半胱氨酸蛋白酶mtcp6和mtvpe[6]，与根瘤衰老相关联。豌豆中pscyp15a[7]在根瘤共生体中表达以及大豆中cp基因[8]和苜蓿中mtcp77基因[9]参与根瘤细胞的程序性细胞死亡。因此，探索研究半胱氨酸蛋白酶在豆科植物根瘤固氮中的调控机制具有重要意义，以使得借助基因工程调节根瘤共生固氮效率成为可能。

技术实现思路

1、在农作物育种中，结瘤数目过多或过少均会影响农作物的产量，因此需要对结瘤数目进行调控[10]。本发明的目的是提供一种调控豆科植物根瘤共生固氮或结瘤数目的基因及其应用。

2、发明人运用分子生物学和比较基因组学的手段，分别从美国大豆种系williams82中克隆到一个调控大豆(glycine max)结瘤数目的相关基因glyma.15g177800(在本文中也称为gmctsh)，从蒺藜苜蓿(medicago truncatula)种系a17中克隆到一个调节蒺藜苜蓿结瘤数目的gmctsh的同源基因medtr4g125300(在本文中也称为mtctsh)。gmctsh编码基因在williams 82a2.v1版本测序基因组中的位置为chr15:16892475..16897664，mtctsh编码基因在a17 4.0v1版本测序基因组中的位置为chr4:51952476..51956344。gmctsh和mtctsh的克隆为后续分子辅助育种和分子设计育种提供理论基础和基因资源。

3、其中，在本发明的具体实施方案中，所述gmctsh基因的cdna序列如seq id no:1所示，所述mtctsh基因的cdna序列如seq id no:2所示。在本发明的具体实施方案中，所述gmctsh基因的氨基酸序列如seq id no:3所示，所述mtctsh基因的氨基酸序列如seq idno:4所示。

4、发明人发现，gmctsh蛋白和mtctsh蛋白在利用植物表达载体如发根农杆菌进行rnai时，与来源种系相比，获得的植株的结瘤数目出现了显著减少。这样的效果是基于现有的技术预料不到的，由此，本技术提供了一种分离的蛋白质，其为大豆和蒺藜苜蓿根瘤菌共生固氮相关蛋白，以及首次注释其编码序列在大豆和蒺藜苜蓿基因组中的功能。

5、本发明中，可用现有的植物表达载体构建含有目的基因的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述植物表达载体中还可以包含增强子，以增加插入的核苷酸片段的表达。

6、为实现上述目的，本发明还提供一种获得转基因毛状根的方法，其是将前述核酸或包含前述基因的载体或宿主细胞导入目的豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿中，得到与所述目的豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿相比表现为结瘤数目改变的豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿毛状根。

7、为实现上述目的，本发明还提供一种如前所述的蛋白质或如前所述的核酸或包含前述基因的载体或宿主细胞在豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿基因工程中的应用。

8、本发明提供的大豆和蒺藜苜蓿结瘤数目相关蛋白及其编码核酸在调控大豆和蒺藜苜蓿结瘤数目方面的功能均为申请人的首次发现，且经过转基因毛状根和转空载体毛状根植株的表型分析验证说明表达本发明的大豆和蒺藜苜蓿结瘤数目相关蛋白能够使大豆或蒺藜苜蓿转基因毛状根结瘤数目减少。本发明对于调节大豆或蒺藜苜蓿根瘤数目及其相关应用研究将具有重大理论和应用价值。

9、具体来说，本发明提供以下技术方案：

10、一方面，本发明提供分离的调控大豆或蒺藜苜蓿结瘤数目的基因，所述基因的编码区序列如seq id no:1或seq id no:2所示或其同源序列。

11、另一方面，本发明提供调控大豆或蒺藜苜蓿结瘤数目的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no:3或seq id no:4所示或其同源序列。

12、另一方面，本发明提供表达载体，所述表达载体包含如上所述的基因或编码如上所述的蛋白质的核苷酸序列，或包含抑制如上所述的基因或蛋白质表达的序列，例如所述基因的干扰序列或编码所述蛋白质的核苷酸序列的干扰序列。

13、在一些实施方案中，所述表达载体包含标记，任选地，所述标记选自发光标记、抗生素标记和抗化学试剂标记，任选地，所述发光标记选自红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，所述抗生素标记选自氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、利福平、壮观霉素、潮霉素、链霉素和四环素，所述抗化学试剂标记例如抗除草剂标记。

14、另一方面，本发明提供宿主细胞，其包含如上所述的表达载体。

15、另一方面，本发明提供获得大豆毛状根的方法，其包括将如上所述的基因或编码如上所述的蛋白质的核苷酸序列或如上所述的表达载体或宿主细胞转化到豆科植物例如大豆或蒺藜苜蓿细胞或组织中并培育出转基因毛状根。

16、在一些实施方案中，所述载体为植物表达载体，包括双元发根农杆菌载体和/或可用于植物微弹轰击的载体。

17、在一些实施方案中，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞(例如发根农杆菌细胞)或植物细胞。

18、在一些实施方案中，所述发根农杆菌选自k599、ar1193、c58cl、arqual、msu440、lba9402和r1601。

19、另一方面，本发明提供如上所述的基因或编码如上所述的蛋白质的核苷酸序列或如上所述的表达载体或宿主细胞在培育结瘤数目改变的豆科植物例如大豆或苜蓿中的用途。

20、在一些实施方案中，所述结瘤数目改变表现为结瘤数目和/或单位根长结瘤数目增加。

21、在一些实施方案中，所述结瘤数目改变表现为结瘤数目和/或单位根长结瘤数目减少。

22、另一方面，本发明提供培育产量提高或结瘤数目和/或单位根长结瘤数目改变的转基因植物的方法，其包括将如上所述的基因或编码如上所述的蛋白质的核苷酸序列或如上所述的表达载体或宿主细胞引入到目的植物细胞或组织中得到转基因植物，与所述目的植物相比，所述转基因植物的产量提高或结瘤数目改变，所述植物为豆科植物，优选大豆和蒺藜苜蓿，任选地，所述结瘤数目改变表现为结瘤数目和/或单位根长结瘤数目增加，任选地，所述结瘤数目改变表现为结瘤数目和/或单位根长结瘤数目减少。

23、定义

24、cds序列：cds是转录本中实际翻译成蛋白质的部分，即外显子的序列。它代表了基因中编码氨基酸的序列，是蛋白质合成的直接模板。cds通常不包括内含子，因为内含子在转录后的加工过程中剪接掉，只留下编码蛋白质的外显子序列。

25、转录本序列：转录本是基因转录产生的rna分子，包括mrna、trna和rrna等。转录本可能包含内含子和外显子，内汉字在转录后加工过程中被剪接掉，而外显子则保留下来，最终用于编码蛋白质。