花蓟马钠离子通道α亚基T929I突变部位及抗药性快速检测方法

本发明涉及基因突变部位检测及应用，特别是涉及一种花蓟马钠离子通道α亚基t929i突变部位及抗药性快速检测方法。

背景技术：

1、农作物及牧草有害生物会严重为害农业及牧草种植的发展，目前已报道的农作物及牧草有害生物种类繁多，其中，小菜蛾、西花蓟马、蝗虫、草地贪夜蛾、稻瘟病等均会对植物造成严重为害。有害生物防控工作中生物源农药防治和化学农药防治为关键性手段，其他措施只能作为预防性或辅助性措施。生物源农药和化学农药的不合理使用容易对有害生物产生抗性，生物源农药长期使用不可避免亦对有害生物产生抗药性问题。有害生物产生抗药性往往会导致加大防治难度。同时，有害生物的抗药性迫使农药使用量增加，造成农产品农药残留及环境污染，且杀伤多种非靶标生物。

2、拟除虫菊酯类杀虫剂是生物源农药，目前世界范围内广泛使用的杀虫剂种类之一。其具有作用方式、靶标部位、对害虫高效、对哺乳动物低毒、对环境相容性好等特点。在农业生产中的害虫防控上具有主导作用。随着拟除虫菊酯类杀虫剂的不科学、不规范使用，导致害虫对其产生的抗药性快速发展。现在，害虫的拟除虫菊酯类杀虫剂抗性成已为国内外重要课题。

3、花蓟马frankliniella intonsa(trybom)是一种设施农业及牧草重要害虫。该害虫寄主植物54科179种，在设施农业中主要为害草莓，种植牧草中主要为害苜蓿，以其锉吸口器吸食作物的茎、叶、花、果实等部位的表面及其汁液，受害新叶不能张开，生长部位萎缩，叶片表面卷曲变畸形，致使整株生长缓慢。受害花瓣颜色变淡褐色，吸食花粉致柱头损伤，严重时缺少营养花蕾脱落。果实受害后表面白化或被害部位硬化导致生长受阻而果实畸形。该害虫直接为害的同时携带番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,tswv)和凤仙花坏死斑病毒(impatiens necrotic spot virus,insv)等植物病毒。据报道，传播病毒的间接为害远远大于其直接为害造成的经济损失。严重影响寄主植物的苗期、花期和果期。造成作物产量降低。花蓟马具有世代周期短、繁殖力强、个体存活率高等特点，对于杀虫剂易产生抗药性。

4、中国专利申请cn112322750a公开了桃蚜烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基v101i突变点检测技术。中国专利申请cn115141890a建立了二化螟gaba受体rdl1亚基a282s突变的分子检测方法。但是，对于花蓟马的拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的快速诊断技术尚未报道。但是，对于花蓟马抗药性检测方法存在所需时间长、抗性因素不明、试验要求高、人力要求高等问题。

技术实现思路

1、为解决现有花蓟马抗药性检测方法中存在的所需时间长、抗性因素不明等问题，本发明提供了一种花蓟马钠离子通道α亚基t929i突变部位及抗药性快速检测方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种花蓟马钠离子通道α亚基t929i突变部位快速检测方法，在钠离子通道α亚基第929氨基酸部位的序列表的序列1所示435bp序列片段上，酶切检测在钠离子通道α亚基第929氨基酸部位的突变位点为acc置换为atc，第929位上的苏氨酸(t)变成异亮氨酸(i)。

3、优选地，所述酶切检测包括如下步骤：

4、步骤(1)：提取花蓟马多条雌成虫总rna；

5、步骤(2)：建立目的序列cdna片段pcr扩增体系，包括序列表中序列2和序列3所示一对特异性引物、premix taqtm、目的序列cdna、ddh2o；

6、步骤(3)：进行pcr扩增，反应条件如下：98℃预变性30min，35个循环:98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min，并4℃环境保存；

7、步骤(4)：利用t929i突变部位酶切的内切酶mbo i和dpnii，进行酶切反应：在37℃条件下15min孵育，再65℃条件下20min热灭活；

8、步骤(5)：将酶切产物使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果中若出现269bp和170bp条带，表示为非检测部位切割；若出现95bp或178bp条带，表示为检测部位切割。

9、优选地，所述mbo i酶切反应体为1μl pcr扩增产物、5μl 10×nebuffe、1μl mbo irestriction enzyme、43μl nuclease-free water；所述dpnii酶切反应体为1μl pcr扩增产物、5μl 10×nebuffe、1μl dpnii restriction enzyme、43μl nuclease-free water。

10、基于上述技术方案，本发明还提供了一种花蓟马种群对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性快速检测方法，在钠离子通道α亚基第929氨基酸部位的序列表的序列1所示435bp序列片段上，酶切检测在钠离子通道α亚基第929氨基酸部位的突变位点为acc置换为atc，第929位上的苏氨酸(t)变成异亮氨酸(i)；其中所述酶切检测包括如下步骤：

11、步骤(1)：提取花蓟马多条雌成虫总rna；

12、步骤(2)：建立目的序列cdna片段pcr扩增体系，包括序列表中序列2和序列3所示一对特异性引物、premix taqtm、目的序列cdna、ddh2o；

13、步骤(3)：进行pcr扩增，反应条件如下：98℃预变性30min，35个循环:98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min，并4℃环境保存；

14、步骤(4)：利用t929i突变部位酶切的内切酶mbo i和dpnii，进行酶切反应：在37℃条件下15min孵育，再65℃条件下20min热灭活；所述mbo i酶切反应体为1μl pcr扩增产物、5μl 10×nebuffe、1μl mbo i restriction enzyme、43μl nuclease-free water；所述dpnii酶切反应体为1μl pcr扩增产物、5μl 10×nebuffe、1μl dpnii restrictionenzyme、43μl nuclease-free water；

15、步骤(5)：将酶切产物使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果中若出现95bp或178bp条带，则表明为花蓟马种群对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性；酶切产物电泳结果中若不出现95bp或178bp条带，则表明花蓟马种群对拟除虫菊酯类杀虫剂敏感。

16、基于上述技术方案，本发明的优点是：

17、本发明的快速检测方法为100头花蓟马雌成虫的总rna提取；合成cdna；设计含突变部位的特异性引物；目标片段扩增；建立酶切体系；产物琼脂糖凝胶电泳结果的dna片段条带判定是否编码抗性型氨基酸。本发明具备特异性强、稳定性好、灵敏度高、操作简便、用时短等优点。基于内酶切技术建立的花蓟马钠离子通道α亚基t929i突变部位是否编码为变异型氨基酸的快速检测，为花蓟马野生种群是否对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的检测，提供快速诊断技术，并为花蓟马的科学防治、合理选药提供准确的判定依据，适用于农作物及牧草花蓟马防控工作。

18、本发明的快速检测方法具有所需时间短、特异性强、对设备要求低、结果易于观察等优点，非常适合花蓟马种群基因变异快速诊断，对于科学指导用药、降低生产成本和减少环境污染的重要意义。与传统的花蓟马抗药性检测方法相比，本发明提供的诊断技术具有以下优势:

19、本发明提供的快速检测方法具有高度的特异性，可特异诊断钠离子通道α亚基t929i突变，对于未突变的野生型则无法酶切。

20、本发明的快速检测方法具有极高的准确性，判断为抗药性诊断结果的样品与钠离子通道α亚基t929i突变的准确性高。

21、本发明的快速检测方法在300分钟内即可完成诊断，极大地缩短了花蓟马抗药性诊断的周期，提高了诊断的工作效率。

22、本发明的快速检测方法只需在分子实验简单操作的条件下均可运行诊断，操作步骤简单，不需要复杂的实验操作步骤。

23、本发明的快速检测方法可通过观察电泳的琼脂糖凝胶dna条带出现情况，是否出现95bp或178bp条带的简单判定方法，确定花蓟马种群对拟除虫菊酯类杀虫剂是否产生抗药性。