一种在毕赤酵母中表达人源IGF-1与IGFBP3的IGF-1结合区段复合物的方法与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种在毕赤酵母中表达人源igf-1与igfbp3的igf-1结合区段复合物的方法。

背景技术：

1、igf-1(insulin-like growth factor-1)是一类胰岛素样生长因子，也被称为生长调节素c，其化学结构与胰岛素相似，是体内重要的细胞因子之一。人igf-1是由70个氨基酸组成的碱性多肽链，有6个半胱氨酸(cys)，形成三对链内二硫键。血清中的大部分igf-1是与蛋白igfbp3(igf bindingprotein 3)及als(acid-labile subunit)结合组成igf-1/igfbp3/als三元复合物，该复合物可以延长igf-1的血清半衰期并调节其功能。在特定条件下，三元复合物中的igfbp3被特定的蛋白酶酶解，从而使igf-1从复合物中释放出来。释放出的igf-1特异地结合到细胞表面的igf-1受体igf1r(igf-1receptor)，使igf1r的β亚基构象发生改变，激活酪氨酸激酶活性，并级联活化pi3k-mapk通路，从而发挥其各种生物学活性。lr3 igf-1(long r3igf-1)是igf-1的一个类似物。

2、为了提高人igf-1或lr3 igf-1的重组表达能力，现有技术有报道，在毕赤酵母中通过融合蛋白促进目的蛋白的表达，在igf-1或lr3 igf-1的n端融合木聚糖酶基因xyncdbfv，获得xyncdbfv-igf-1或lr3 igf-1蛋白。在该技术中，木聚糖酶与igf-1融合，中间用内源蛋白酶kex2位点连接，检测不到igf-1的表达，而改用外源蛋白酶tev位点连接，才能得到木聚糖酶与igf-1的融合蛋白的表达，纯化出融合蛋白后，再用商品化的tev蛋白酶酶切，得到单独的igf-1；木聚糖酶与igf-1融合蛋白的表达量为0.5g/l,需要外源tev蛋白酶酶切，并再次纯化后，才能得到有活性的igf-1。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种在毕赤酵母中表达人源igf-1与igfbp3的igf-1结合区段复合物的方法。

2、根据本发明的在毕赤酵母中表达人源igf-1与igfbp3的igf-1结合区段复合物的方法包括以下步骤：

3、合成优化的毕赤酵母偏爱的编码人源igf-1的基因、优化的毕赤酵母偏爱的编码人源igfbp3的igf-1结合区段的基因，其中，所述人源igf-1的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述人源igfbp3的igf-1结合区段的氨基酸序列如seq id no：2所示；

4、构建融合表达载体，所述融合表达载体包括表达所述人源igf-1与所述人源igfbp3的igf-1结合区段的表达盒；

5、将构建的融合表达载体线性化后转化毕赤酵母，获得重组毕赤酵母，培养所述重组毕赤酵母，从而表达所述人源igf-1与igfbp3的igf-1结合区段复合物。

6、人源igf-1，seq id no：1：

7、gp etlcgaelvd alqfvcgdrg fyfnkptgyg sssrrapqtg ivdeccfrsc dlrrlemycaplkpaksa；

8、人源igfbp3的igf-1结合区段，seq id no：2所示：

9、gassaglgpvvrcepcdaralaqcapppavcaelvrepgcgccltcalsegqpcgiytercgsglrcqpspdearplqalldgrglcvnasavsrlrayllpappa；

10、根据本发明的在毕赤酵母中表达人源igf-1与igfbp3的igf-1结合区段复合物的方法，其中，所述优化的毕赤酵母偏爱的编码人源igf-1的基因的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述优化的毕赤酵母偏爱的编码人源igfbp3的igf-1结合区段的基因的核苷酸序列如seq id no：4所示。

11、人源igf-1的基因，seq id no：3：

12、ggtcctgagactttgtgtggagcagagcttgtcgatgctttgcagttcgtttgtggagatcgtggattttacttcaataagcct accggttacggttcatcctctcgtagagcaccacagaccggcatcgttgatgagtgctgtttcagatcctgtgacttgcgtagacttg agatgtattgcgctcctctgaagcctgctaagtctgct。

13、人源igfbp3的igf-1结合区段基因，seq id no：4：

14、ggtgcttcttctgctggtttgggtcctgttgttagatgtgaaccttgtgatgctagagctttggctcaatgtgctccaccacctgctgtttgtgctgaattggttagagaaccaggttgtggttgttgtttgacttgtgctttgtctgaaggtcaaccatgtggtatttacactgaaagatgtggttctggtttgagatgtcaaccttctcctgatgaagctagacctttgcaagctttgttggatggtagaggtttgtgtgttaacgcttctgctgtttctagattgagagcttatttgttgcctgctccacctgct。

15、根据本发明的在毕赤酵母中表达人源igf-1与igfbp3的igf-1结合区段复合物的方法，其中，所述表达盒包括以下操作性连接的元件：aox1启动子，酿酒酵母a-factor信号肽编码基因、所述优化的毕赤酵母偏爱的编码人源igfbp3的igf-1结合区段的基因、所述优化的毕赤酵母偏爱的编码人源igf-1的基因、终止子。

16、根据本发明的在毕赤酵母中表达人源igf-1与igfbp3的igf-1结合区段复合物的方法，其中，在所述酿酒酵母a-factor信号肽编码基因与igfbp3的igf-1结合区段基因之间包含内源蛋白酶kex2位点(kreaea)；在所述igfbp3基因与所述人igf-1基因序列之间包含linker序列(rsg)和内源蛋白酶kex2位点(kreaea)；在终止子之前含有his标签序列。

17、本技术的发明人在研究过程中，首先将全长人igfbp3分别与人igf-1及其类似物lr3 igf-1融合，中间用内源蛋白酶kex2位点连接，结果igfbp3与igf-1的融合蛋白得到表达，但是仅表达igfbp3的n端(与igf-1的结合区段)与igf-1复合物,c端可能被切开；而igfbp3与lr3 igf-1的融合蛋白未检测到表达。因此，本技术确定用igfbp3的igf-1的结合区段与igf-1融合表达，并且意外发现，当旨在用igf-1c端的his标签亲和层析纯化igf-1时，却未得到单一的igf-1蛋白，而是得到igfbp3的igf-1的结合区段与igf-1的复合物，并且在sds-page胶上也未分开。

18、本技术的有益技术效果：

19、根据本技术的技术方案，igfbp3的igf-1结合区段(igf-1的n端)与igf-1融合，即使中间用内源蛋白酶kex2位点连接，也可以检测到igf-1的表达，并且通过连接在igf-1c端的his标签亲和层析，直接得到结合在一起的igfbp3的igf-1结合区段与igf-1的复合物蛋白；

20、本发明通过设计酵母内源蛋白酶酶切位点(kreaea)实现融合蛋白的切割，并且由于igfbp3 igf-1结合区段与igf-1结合紧密，纯化得到的蛋白为igfbp3的igf-1结合区段与igf-1的混合物，该混合物具有生物活性。

21、并且，igfbp3的igf-1结合区段与igf-1的复合物表达量达到1g/l，只需一步纯化即可，并且不需要商品化酶切割，提高了得率，降低了成本。