含有膜型RGD的融合蛋白和表达该融合蛋白的免疫细胞及其应用

本发明属于基因工程和肿瘤免疫治疗领域，具体地说，涉及一种含有膜型rgd的融合蛋白和表达该融合蛋白的免疫细胞及其应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤的治疗长期面临艰巨挑战，免疫疗法成为治疗恶性肿瘤的有效策略之一，其核心优势在于激发机体自身的免疫系统对抗肿瘤，主要包括抗体治疗、细胞治疗和免疫调节剂治疗等。其中，基因修饰t细胞疗法在恶性肿瘤治疗领域取得突破性进展，主要包括嵌合抗原受体基因修饰t细胞（car-t）和t细胞受体基因修饰t细胞（tcr-t）。car-t细胞疗法在血液系统肿瘤治疗领域取得突破性进展，已有靶向cd19 car-t细胞产品在我国上市。然而，car-t和tcr-t等细胞疗法在实体瘤中进展缓慢，究其原因：1）实体瘤具有高度异质性，其中肿瘤细胞表面抗原（肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原，tsa/taa）表达存在显著差异，继而降低car-t等免疫细胞的肿瘤杀伤能力；2）实体瘤相关的肿瘤抗原不仅在肿瘤组织表达而且可能在正常组织表达，从而出现脱靶效应；3）car-t等免疫细胞通过外周血输送至体内后，需要有效归巢至肿瘤部位发挥作用，然而实体瘤形成坚实的团块，加上丰富的肿瘤相关成纤维细胞（caf）和血管等形成天然物理屏障抑制car-t等细胞的归巢以及杀伤能力，导致治疗效果不佳。4）实体瘤存在免疫抑制微环境，如调节性t细胞（treg）、骨髓源抑制性细胞（mdsc）和m2型巨噬细胞等通过释放转化生长因子β（tgfβ）和白细胞介素-10（il-10）等细胞因子，降低回输后car-t的抗肿瘤效果。

2、整合素家族是一个由多个结构和功能相似蛋白所组成的膜受体家族，在哺乳动物中已经发现由18 种α亚基和 8 种β亚基形成 的24 种功能不同的跨膜异二聚体糖蛋白，其α和β亚基共同决定整合素的受体特性。整合素是主要的细胞粘附跨膜受体，作为细胞外基质（ecm）与骨架连接体、细胞与其环境之间的生化和机械信号转导体发挥作用，是恶性肿瘤致密性的重要介导成分。已有研究表明整合素在多种恶性肿瘤如骨肉瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等显著高表达，且其与ecm连接后促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等恶性表型。1970年研究发现（arg-gly-asp）rgd 三肽是整合素的结合基团，可作为细胞粘附配体。rgd 与癌细胞上过度表达的整合素具有高亲和力，可实现肿瘤的靶向诊断和治疗。

3、基于已有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种携带膜型rgd融合蛋白和表达该融合蛋白的免疫细胞制备及应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种含有膜型rgd的融合蛋白和表达该融合蛋白的免疫细胞及其应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种含有膜型rgd的融合蛋白，所述融合蛋白包含膜型rgd融合蛋白或膜型串联rgd融合蛋白以及car结构（嵌合抗原受体），且car结构位于所述融合蛋白的c端。

3、本发明采用rgd膜锚定表达设计，1）通过rgd的肿瘤靶向性，促进car-t细胞的肿瘤浸润能力；2）rgd与整合素识别抑制整合素激活信号，从而抑制肿瘤恶性表型，解除肿瘤免疫抑制微环境；3）膜型rgd分子量小，仅300bp左右，对car结构的表达无影响；可通过串联多个rgd分子，进一步提升car-t细胞的肿瘤浸润能力。

4、进一步地，所述膜型rgd肽的结构为：rgd肽-cd8a铰链区-cd8a跨膜区。

5、进一步地，所述膜型串联rgd肽的结构为：rgd肽-linker-flag标签-linker-rgd肽-cd8a铰链区-cd8a跨膜区。

6、本发明中，所述rgd肽为包含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸结构的小肽，优选氨基酸序列为：acdcrgdcfcg。

7、进一步地，所述car结构包括抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内信号域（包括共刺激结构域和信号转导结构域）。

8、进一步地，所述串联rgd肽中，所述flag标签为dykddddk，所述linker为（ggggs）n，n为1至100的整数，优选n为1。

9、进一步地，所述car结构为：抗pmsa scfv（单链可变片段）-cd28铰链区-cd28跨膜区-41bb-cd3ζ。

10、进一步地，所述膜型rgd肽或所述膜型串联rgd肽与car结构之间为自裂解肽。

11、进一步地，所述自裂解肽为2a肽，如t2a、p2a、e2a或f2a。

12、第二方面，本发明提供编码所述融合蛋白的核酸分子。

13、第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料。

14、所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

15、第四方面，本发明提供一种表达所述融合蛋白的免疫细胞，其是将编码所述融合蛋白的基因通过载体（如慢病毒载体）导入免疫细胞中构建得到的。

16、进一步地，所述免疫细胞是来源于哺乳动物的免疫细胞，如t淋巴细胞（t细胞）、自然杀伤细胞（nk细胞）、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞（dc细胞）等。

17、优选地，所述免疫细胞为t细胞。

18、所述t细胞进一步表达结合肿瘤抗原的t细胞受体（tcr）。

19、本发明提供的膜型rgd car-t细胞的结构示意图见图1。

20、第五方面，本发明提供所述免疫细胞在制备抗肿瘤药物或组合物中的应用。

21、第六方面，本发明提供所述免疫细胞在肿瘤治疗中的应用。

22、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

23、（一）本发明采用rgd作为整合素特异性识别小肽，已用于影像诊断、疾病治疗，有效性和安全性得到充分验证，rgd作为整合素特异性配体，具有良好的肿瘤靶向性。

24、（二）本发明通过构建膜型rgd car-t细胞，一方面，靶向整合素充分抑制肿瘤的间质保护和肿瘤恶性表型；另一方面，可有效改善肿瘤免疫抑制微环境，促进car-t细胞对实体瘤的浸润和杀伤能力。

25、（三）实验结果表明，本发明提供的表达膜型rgd的细胞治疗新产品（rgd car-t细胞），与普通car-t细胞的感染效率无显著差别，且功能实验结果表明膜型rgd结构显著增加car-t细胞对实体瘤的体内外杀伤效果以及肿瘤浸润能力。

技术特征：

1.含有膜型rgd的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含膜型rgd肽或膜型串联rgd肽以及car结构，且car结构位于所述融合蛋白的c端；

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述串联rgd肽中，所述flag标签为dykddddk，所述linker为（ggggs）n，n为1至100的整数。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述car结构为：抗pmsa scfv-cd28铰链区-cd28跨膜区-41bb-cd3ζ。

4.根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述膜型rgd肽或所述膜型串联rgd肽与car结构之间为自裂解肽；

5.编码权利要求1-4任一项所述融合蛋白的核酸分子以及含有所述核酸分子的生物材料；

6.表达权利要求1-4任一项所述融合蛋白的免疫细胞，其特征在于，其是将编码所述融合蛋白的基因通过载体导入免疫细胞中构建得到的；

7.根据权利要求6所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括t淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞。

8.根据权利要求6所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为t细胞。

9.根据权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于，所述t细胞进一步表达结合肿瘤抗原的t细胞受体。

10.权利要求6-9任一项所述免疫细胞在制备抗肿瘤药物或组合物中的应用。

技术总结本发明属于基因工程和肿瘤免疫治疗领域，公开了一种含有膜型RGD的融合蛋白和表达该融合蛋白的免疫细胞及其应用，具体提供一种能同时靶向实体瘤整合素和肿瘤细胞膜表面抗原且更易浸润到肿瘤组织的免疫细胞。具体而言，本发明所述融合蛋白包含RGD肽或串联RGD肽以及靶向实体瘤的CAR结构。本发明采用RGD作为整合素特异性识别小肽，通过构建膜型RGD CAR‑T细胞，既可通过靶向整合素充分抑制肿瘤中整合素激活导致的恶性表型，又显著增强实体瘤中CAR‑T等细胞治疗产品的实体瘤浸润能力和肿瘤杀伤能力。技术研发人员：戎卓娜,庞晓丛,周颖,滕霞,肖卜凡,王喆,王文毅,刘鸿金受保护的技术使用者：北京大学第一医院（北京大学第一临床医学院）技术研发日：技术公布日：2024/11/14