一种核桃降血糖肽的制备方法

本发明涉及一种降血糖肽的制备方法，具体涉及一种利用核桃制备降血糖肽的方法。

背景技术：

1、糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，主要分为i型、ii型(type2diabetes，t2d)和妊娠型。t2d的患者比例更是高达总糖尿病患病人数的90％以上，是一种胰岛素信号受损或缺失引起的非传染性内分泌疾病。根据国际糖尿病联合会2021年的数据显示，世界上约有5.4亿成人(20～79岁)患有糖尿病，我国病患人数占比达到26％。持续的高血糖和长期代谢紊乱等可导致全身组织器官，特别是肾、眼、神经系统及心血管的损害和功能衰竭或障碍。因此，迫切需要研发安全有效的活性物质以有效干预t2d。

2、二肽基肽酶iv(dpp-iv)是一种多功能的跨膜糖蛋白，广泛分布于人体器官和组织。dpp-iv主要作用于胰高血糖素样肽-1(glp-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)，破坏其链段，使其丧失功能而不能刺激胰岛素的分泌，从而失去保持餐后血糖平衡的能力。因此，抑制dpp-iv活性被证实是治疗t2d的一种有效且安全的治疗方法。α-葡萄糖苷酶主要位于小肠黏膜刷状缘细胞处，是调控餐后血糖的靶酶，α-葡萄糖苷酶在催化碳水化合物最后一步消化的过程中至关重要，抑制其活性可以干扰膳食中碳水化合物消化产生葡萄糖，从而实现对餐后血糖的良好控制。

3、核桃是世界四大干果之一且营养价值丰富。核桃仁作为核桃的主要食用部分，集蛋白质、脂类、碳水化合物、纤维素、维生素和矿物质等营养素于一身。核桃蛋白是一种优质的植物蛋白，包含有18种氨基酸，且8种人体必需氨基酸种类齐全、比例均衡。而核桃饼粕作为核桃提油后的副产物，通常被用作饲料或被大量丢弃，这会造成不必要的资源浪费和环境污染。因此，对核桃粕蛋白进行精深加工，提高核桃资源综合利用效率，是核桃资源利用的焦点。因此，开发一种基于核桃制备降血糖肽的方法具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种核桃降血糖肽的制备方法，该方法制备了一种同时具有较高dpp-ⅳ酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽lpwr，该核桃降血糖肽对正常小鼠的葡萄糖代谢有显著地改善作用。因此，本发明的核桃降血糖肽为ⅱ型糖尿病治疗改善提供了理论基础。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种核桃降血糖肽的制备方法，包括如下步骤：

4、步骤一、制备脱脂核桃粉：将核桃去壳、粉碎后，与正己烷溶液混合在37℃摇床中脱脂，脱脂核桃粕风干、粉碎后过筛，得到脱脂核桃粉；

5、步骤二、提取核桃蛋白：将脱脂核桃粉与蒸馏水按照1:8～12(w/v)混合，利用naoh调节溶液ph至9.5～10.5，用磁力搅拌器50～60℃浸提1～2h后，离心取上清液；用hcl溶液调节上清液的ph至4.0～4.5，充分搅拌1～2h，离心后取下层沉淀，将沉淀透析脱盐后冻干处理，得到核桃蛋白；

6、步骤三、制备核桃粕粗肽：将核桃蛋白以2～4％(w/v)溶于蒸馏水中形成核桃蛋白溶液并于90～100℃水浴锅中处理10～30min，然后将核桃蛋白溶液的温度调至35～40℃，ph调至7.8～8.5，加入6000u/g的胰蛋白酶进行反应，酶解反应结束后置于沸水浴中10～15min，离心取上清液并冷冻干燥得到核桃粕粗肽；

7、步骤四、dpp-ⅳ酶和α-葡萄糖苷酶抑制肽分离：将核桃粗肽通过deae-52纤维素离子交换柱初步分离纯化，依次利用0.02mol/l pbs和0.1、0.2、0.3、0.4mol/l的nacl溶液进行洗脱，并将收集的样品溶液透析脱盐后冻干，测定不同组分对dpp-ⅳ酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性；

8、步骤五、dpp-ⅳ酶和α-葡萄糖苷酶抑制肽筛选：将步骤四筛选的抑制活性最好的分离组分配制成6～10mg/ml的样品溶液，利用sephadex-g25葡聚糖凝胶柱进一步分离纯化，使用蒸馏水洗脱，将洗脱组分富集冻干后，得到核桃降血糖肽。

9、相比于现有技术，本发明具有如下优点：

10、本发明制备的降血糖肽为leu-pro-trp-arg(lpwr)，分子量为571.34da，且同时具有较高dpp-ⅳ酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，ic50值分别为278.6μm和353.0μm。lpwr主要通过氢键和范德华力与dpp-ⅳ酶和α-葡萄糖苷酶紧密结合。在正常小鼠葡萄糖负荷(2g/kg体重)后，40mg/kg的lpwr可使小鼠餐后血糖水平较对照组降低。并且，经lpwr处理的小鼠，其血清中胰岛素、glp-1和gip的含量较对照组升高。本发明揭示的核桃肽的降糖作用机制研究可为后续高效、灵敏、安全的降糖膳食补充剂的开发提供理论依据和参考，并强化核桃的高值化利用途径。

技术特征：

1.一种核桃降血糖肽的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的核桃降血糖肽的制备方法，其特征在于所述步骤一中，核桃与正己烷按照1：3～5(w/v)混合。

3.根据权利要求1所述的核桃降血糖肽的制备方法，其特征在于所述步骤四中，核桃粗肽的浓度为8～10mg/ml，上样量为6～10ml，设置流速为2ml/min。

技术总结本发明公开了一种核桃降血糖肽的制备方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、制备脱脂核桃粉；步骤二、提取核桃蛋白；步骤三、制备核桃粕粗肽；步骤四、DPP‑Ⅳ酶和α‑葡萄糖苷酶抑制肽分离；步骤五、DPP‑Ⅳ酶和α‑葡萄糖苷酶抑制肽筛选。该方法制备了一种同时具有较高DPP‑Ⅳ酶和α‑葡萄糖苷酶抑制活性的肽LPWR，分子量为571.34Da，IC<subgt;50</subgt;值分别为278.6μM和353.0μM。LPWR主要通过氢键和范德华力与DPP‑Ⅳ酶和α‑葡萄糖苷酶紧密结合。该核桃降血糖肽对正常小鼠的葡萄糖代谢有显著地改善作用。因此，本发明的核桃降血糖肽为Ⅱ型糖尿病治疗改善提供了理论基础。技术研发人员：王荣春,穆欣欣,关凯方,刘小琳受保护的技术使用者：哈尔滨工业大学技术研发日：技术公布日：2024/11/14