一种免疫检查点PD-L2靶向单链抗体及放射性核素标记物与应用

本发明属于医学生物检测技术及放射性化学和核医学领域，具体地，涉及pd-l2特异性抗体片段的筛选及其应用，尤其涉及该抗体片段筛选方法、核素标记及其应用。

背景技术：

1、免疫检查点抑制剂治疗(ici)是肿瘤免疫治疗中重要的一类治疗手段，其机制在于免疫检查点是一类免疫抑制性分子，可以调节免疫的广度和深度，避免正常细胞或组织的损伤和破坏，然而在肿瘤微环境中，肿瘤细胞为了满足自身生长需求，通过一定的手段，抑制免疫系统的功能，使免疫细胞不能正常识别和杀伤肿瘤细胞而造成所谓的免疫逃逸。在免疫逃逸过程中，程序性细胞死亡蛋白-1(pd-1)和其配体发挥出重要作用，pd-1是表达在t细胞表面的一种免疫抑制蛋白，为cd28超家族成员，其配体分为两类分别是pd-l1和pd-l2，两者都能在肿瘤细胞表面表达，肿瘤细胞通过pd-l1或pd-l2与pd-1的结合，最终抑制了免疫细胞对肿瘤的识别和清除能力。ici治疗就是基于免疫检查点，通过阻断受体与配体的结合，克服免疫逃逸，上调免疫功能，继而达到肿瘤抑制或杀伤的目的。随着靶向pd-1/pd-l1单抗类药物的获批和应用，多项前瞻性研究已经证实，ici治疗能显著提高晚期非小细胞癌患者的生存率，延长患者生存时间。但是，如何在治疗前筛选出潜在获益者，在治疗过程中监测ici治疗疗效并及时把握停药指征而有效降低ici治疗副作用，成为该治疗的核心问题。目前，临床上采用免疫组化的方法定量pd-l1的表达以作为筛选患者的手段之一。

2、但是，上述筛选方式一方面存在由于穿刺取材可能造成创伤的问题，且所取的部位可能由于肿瘤的异质性而导致假阴性的结果；另一方面pd-1单抗治疗的临床获益也见于pd-l1阴性的肿瘤患者，这提示仅评估pd-l1对于患者筛选是不够的。因此，本发明将研究对象确定为pd-1的另一个配体pd-l2，pd-l2是pd-1信号通路上的重要配体之一，是继pd-l1后发现的与pd-1结合的第二个重要配体，位于9号染色体，编码的蛋白可与pd-1结合，从而发挥抑制免疫细胞功能的作用，这是pd-l2的主要生物学特性。相较于pd-l1，pd-l2与pd-1结合的亲和力大约高2-6倍，这意味着pd-1可能更倾向于与pd-l2结合。同时，在结直肠癌、食管癌、胰腺癌和肾细胞癌等多个癌种中，pd-l2的表达已被报道为预后不良的独立标志物。结合ici治疗发现，pd-l1和pd-l2均呈阳性的患者(27.5％)的反应率比仅pd-l1阳性的患者(11.4％)更大，且免疫组化结果显示pd-l1和pd-l2的表达存在一定相关性(r2＝0.3930，p<0001)。此外，有研究证实pd-l1单抗治疗效果与pd-l2表达相关，可能的原因在于阻断pd-l1与pd-1的结合后，pd-1可与其配体pd-l2结合，免疫逃逸依然存在。因此，pd-l2有望作为ici治疗潜在获益者的筛选及疗效评价的生物标志物。

3、单链抗体(single-chain variable fragment，scfv)是由抗体重链的可变区与轻链的可变区在一段肽链的连接下构成的小分子，是具有抗体活性的最小功能结构单位。scfv的分子量约为28kda，通过人工合成的连接肽(linker)基因将抗体重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)连接成重组基因，由该重组基因表达的抗体就称为scfv。在结构上，可以将重链的n端与轻链的c端相连，也可以将轻链的n端与重链的c端相连。scfv作为示踪剂其优点在于分子质量小，穿透力强，半衰期短，免疫原性低。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供由噬菌体库展示技术筛选制备的靶向pd-l2单链抗体e6scfv和工程化抗体片段e6scfv-hfc，并提供通过放射性核素标记的放射性示踪剂及其制备方法与应用。本发明提供的放射性核素标记的靶向pd-l2的抗体片段类pet示踪剂，体内外性质稳定，显像效果较好，对pd-l2具有较高的亲和力和特异性。通过临床前评价显示，该系列示踪剂有望成为评估肿瘤pd-l2表达的临床显像剂。

2、为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种免疫检查点pd-l2靶向单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，所述重链可变区(vh)的氨基酸序列为seq id no：1所示，所述轻链可变区(vl)的氨基酸序列为seq id no：2所示。

3、根据一种优选实施方式，所述重链可变区(vh)和所述轻链可变区(vl)之间还设置有连接子linker，优选地，所述连接子linker的氨基酸序列为seq id no：3所示，所述单链抗体的氨基酸序列为seq id no：4所示。

4、为了进一步增加其作为示踪剂的体内稳定性和与靶点的结合能力，本发明进一步融合了人源igg1的可结晶的片段(fc)，修饰成为二价的scfv-hfc抗体片段。具体地，本发明的第二方面提供一种免疫检查点pd-l2靶向工程化抗体片段e6scfv-hfc，所述工程化抗体片段为上述的单链抗体与hfc片段的融合蛋白，优选地，所述hfc片段的氨基酸序列为seqid no：5所示。

5、根据本发明一种更具体的实施方式，工程化抗体片段scfv-hfc为二价抗体，每条链的序列为seq id no：6所示。

6、本发明提供pd-l2靶向工程化抗体片段e6scfv-hfc，所述抗体片段是基于人源单链抗体(scfv)库，通过噬菌体库展示技术所筛选出的e6scfv序列，整合igg1的hfc片段序列后，通过转染在hek293细胞中进行表达，然后通过protein a纯化所得。

7、本发明的第三方面提供一种dna片段，其编码上述的单链抗体或上述的工程化抗体片段。

8、具体地，编码重链可变区(vh)的dna序列为seq id no：7所示，编码轻链可变区(vl)的dna序列为seq id no：8所示。

9、根据本发明一种具体实施方式，编码连接子linker的dna序列为seq id no：9所示，编码单链抗体的dna片段的序列为seq id no：10所示。

10、根据本发明一种具体实施方式，编码hfc片段的dna序列为seq id no：11所示，编码工程化抗体片段的序列为seq id no：12所示。

11、本发明的第四方面提供一种放射性核素标记的工程化抗体片段，所述工程化抗体片段为上述的工程化抗体片段。

12、本发明提供放射性核素标记的抗体片段e6scfv-hfc，所述放射性核素标记的e6scfv-hfc由所述抗体片段e6scfv-hfc以n-溴代琥珀酰亚胺介导、或者与双功能螯合剂偶联后，进行放射性核素标记得到。

13、在本发明中，所述放射性核素优选为碘的放射性同位素、68ga、64cu、89zr、18f、177lu、225ac、86y、90y、111in、11c、211at、153sm、186re、188re、67cu、212pb、213bi、212bi和99mtc中的至少一种，所述碘的放射性同位素优选为124i、123i、125i或131i。

14、所述双功能螯合剂包括但不限于nota、dota、dfo、resca、dtpa、thp、hynic和shnh中的至少一种。

15、本发明的第五方面提供上述的放射性核素标记的工程化抗体片段在制备靶向pd-l2的pet/ct分子诊断显像剂中的应用。

16、本发明的第六方面提供一种靶向pd-l2的诊断或治疗放射性药物，所述药物包含上述放射性核素标记的工程化抗体片段。当所标记核素为成像用放射性核素时，所述药物为诊断用放射性药物，当所述标记核素为治疗用放射性核素时，所述药物为治疗用放射性药物。

17、具体的标记方法可以采用本领域已知的各种核素标记方法。

18、本发明提供所述放射性核素标记的抗体片段e6scfv-hfc的制备方法，所述制备方法可根据采用的核素不同分为两个并列技术方案。

19、对于64cu或89zr标记的靶向pd-l2的抗体片段可以按照如下步骤制备得到：

20、(1)将e6scfv-hfc与双功能螯合剂混合反应得到标记前体，所述e6scfv-hfc与双功能螯合剂的用量摩尔比为1：(8-10)；

21、(2)采用64cu或89zr对所述标记前体进行标记反应，所述标记前体与64cu或89zr的用量比为(0.1-0.3mg)：(6×107-3×108bq)。

22、当采用碘的放射性同位素标记时，所述制备方法包括：将e6scfv-hfc与碘的放射性同位素的盐、n-溴代琥珀酰亚胺和反应缓冲液混合进行标记反应；e6scfv-hfc、碘的放射性同位素的盐和n-溴代琥珀酰亚胺的用量比为(0.1-0.3mg):(60-90kbq/μl):(20-100μg)。

23、根据一种更具体的实施方式，所述制备方法包括：

24、每0.5-1.0ml的60-90kbq/μl的na124i溶液中加入适量0.1m ph＝7.2的pb缓冲液和0.1-0.3mg抗体片段e6scfv-hfc，在加入20-100μg n-溴代琥珀酰亚胺后于常温反应1min，反应完毕后，向反应体系中加入0.1-0.3ml10％人血清白蛋白终止反应；所得反应液用pd-10柱纯化后，得到124i标记的抗体片段124i-e6scfv-hfc。

25、对于其他碘的放射性同位素，如123i、125i、或131i，所用的盐相应为123i盐、125i盐、或131i盐。

26、本发明通过噬菌体库展示技术筛选并通过哺乳动物细胞(hek293)进行真核表达得到e6scfv-hfc，进一步对其进行放射性标记，可以得到靶向pd-l2的新型核素探针。该探针体内外性质稳定，易于制备，对pd-l2有良好的亲和活力。体内micro-pet/ct显像表明，该探针可以有效检出pd-l2高表达肿瘤，这说明其具有发展成无创量化肿瘤pd-l2表达的有力工具，为ici治疗潜在获益者的筛选及疗效评估提供新的策略。

27、本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。