一种高产岩藻糖的大肠杆菌及其构建方法和应用与流程

本申请涉及微生物基因工程，尤其是涉及一种高产岩藻糖的大肠杆菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、岩藻糖(fucose，fuc)是一种广泛存在的天然糖，亦称6-脱氧-半乳糖，l岩藻糖是构成母乳低聚糖的五种单糖之一，是人体八种必须糖之一，广泛存在于动物、植物、藻类中，发挥重要的生理功能。l-岩藻糖可调解肠道菌群，调解肠道健康；可与病毒、细菌、毒素结合，阻止其感染细胞，从而增强机体抵抗力。l-岩藻糖具皮肤保湿功能，延缓皮肤衰老，刺激纤维母细胞增生，防止辐射、紫外线等对纤维母细胞造成的伤害。目前，fuc的商业化生产主要包括海藻酸水解提取岩藻多糖再纯化、化学方法已己糖为原料转化和酶水解产岩藻糖的细菌的胞外多糖等方法，这些l-岩藻糖生产方法存在经济效益低，对环境不友好，应用场景有限等问题，因而发明新的l-岩藻糖生产方法具有潜在的应用价值。生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料，且以较低的环境代价获得高经济产出，因此具有更为广阔的应用前景。

2、在微生物内fuc的合成前体包括胞内自身合成的gdp-l-岩藻糖、2’-岩藻糖基乳糖(2’-fl)以及外源添加乳糖作为媒介。其合成过程是，首先，果糖-6-磷酸在基因mana、manb、manc、gmd和wcag作用下合成gdp-l-岩藻糖，胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶lacy转运至胞内，然后和gdp-l-岩藻糖作用合成2’-fl。2’-fl在α-l-岩藻糖苷酶的作用下分解为岩藻糖和乳糖。但目前fuc的微生物合成产量仍然较低，无法满足大批量工业生产的需求。

技术实现思路

1、本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种降低2’-fl转运效率以提高fuc水平的大肠杆菌及其构建方法和应用。

2、为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：

3、第一方面，本申请提供了一种高产岩藻糖的大肠杆菌，所述大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白表达水平或结合效率降低以及岩藻糖的转运蛋白表达水平提高。

4、作为本申请所述大肠杆菌的优选实施方式，所述大肠杆菌敲除或敲减2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白以及过表达岩藻糖的转运蛋白。

5、作为本申请所述大肠杆菌的优选实施方式，所述2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白包括seta和/或mdfa；所述岩藻糖的转运蛋白包括fucp和/或emrd。

6、根据发明人前期研究发现，2’-fl在合成后较快的排出胞外，无法被α-l-岩藻糖苷酶催化水解为岩藻糖，同时岩藻糖生产后短时间内积累在胞内给细胞带来生存压力，这极大的限制fuc的积累。在此基础上，本申请提供了一种高产岩藻糖的大肠杆菌，在大肠杆菌的基因组中整合了带有强启动子的外源fuc转运蛋白fucp或替换为强启动子的内源转运蛋白emrd，同时敲除了2’-fl转运蛋白seta和/或mdfa，能够使2’-fl的残留量下降，使fuc的产量提高，效果十分显著，具有较高的应用价值。

7、作为本申请所述大肠杆菌的优选实施方式，所述2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白seta的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白mdfa的氨基酸序列如seq id no.2所示。

8、作为本申请所述大肠杆菌的优选实施方式，所述岩藻糖的转运蛋白fucp为来源于大肠杆菌k-12的外源转运蛋白，所述转运蛋白fucp的氨基酸序列如seq id no.3所示。

9、作为本申请所述大肠杆菌的优选实施方式，所述岩藻糖的转运蛋白emrd为内源转运蛋白，所述转运蛋白emrd的氨基酸序列如seq id no.4所示。

10、作为本申请所述大肠杆菌的优选实施方式，所述大肠杆菌以大肠杆菌fuc001为底盘菌株通过将2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白敲除或敲减，将整合后的外源岩藻糖的转运蛋白或内源岩藻糖的转运蛋白的天然启动子替换为强启动子制备得到。

11、作为本申请所述大肠杆菌的优选实施方式，所述强启动子为t7启动子、camv启动子、sv40启动子和sffv启动子中的至少一种。

12、第二方面，本申请提供了上述大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

13、s1、利用基因编辑技术将大肠杆菌fuc001中的2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白敲除或敲减，得到大肠杆菌a；所述2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白包括seta和/或mdfa；

14、s2、将步骤s1所得大肠杆菌a中岩藻糖的转运蛋白编码基因的天然启动子替换为强启动子，得到高产岩藻糖的大肠杆菌；所述岩藻糖的转运蛋白包括fucp和/或emrd。

15、本申请利用基因编辑技术将2’-fl的转运蛋白敲除以降低2’-fl的残留量，从而提高fuc的积累。本申请通过基因编辑技术将转运蛋白编码基因的天然启动子替换为强启动子能够提高内源转运蛋白的表达水平，从而提高lnnt转运至胞外以提高fuc的胞外浓度。

16、作为本申请所述构建方法的优选实施方式，当所述岩藻糖的转运蛋白为fucp时，所述步骤s2的操作如下：构建带有强启动子编码序列和fucp蛋白编码序列的表达盒，将表达盒片段克隆至表达载体中并转化至步骤s1所得大肠杆菌a中，得到高产岩藻糖的大肠杆菌。

17、作为本申请所述构建方法的优选实施方式，所述大肠杆菌fuc001主要由以下步骤制备得到：

18、a1、通过基因编辑技术敲除大肠杆菌bl21star(de3)的β-半乳糖苷酶基因lacz、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucik、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj，得到大肠杆菌ⅰ；

19、a2、将带有磷酸甘露糖突变酶manb、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶manc、gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶gmd和gdp-l-岩藻糖合成酶wcag编码序列的质粒转入步骤a1所得大肠杆菌ⅰ中，得到大肠杆菌ⅱ；

20、a3、将带有α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgl和α-l-岩藻糖苷酶afca编码序列的质粒转入步骤a2所得大肠杆菌ⅱ中，得到大肠杆菌fuc001。

21、第三方面，本申请提供了上述大肠杆菌在生产岩藻糖中的应用。

22、第四方面，本申请提供了一种岩藻糖的生产方法，主要由上述大肠杆菌通过补料分批发酵得到。

23、与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：

24、本申请提供了一种高产岩藻糖的大肠杆菌，在大肠杆菌的基因组中整合了带有强启动子的外源fuc转运蛋白fucp或替换为强启动子的内源转运蛋白emrd，同时敲除了2’-fl转运蛋白seta和/或mdfa，能够使2’-fl的残留量从10-12g/l下降到2g/l以内，使fuc的产量从50.1g/l提高到66.5g/l，效果十分显著，具有较高的应用价值。

技术特征：

1.一种高产岩藻糖的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白表达水平或结合效率降低以及岩藻糖的转运蛋白表达水平提高。

2.如权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于，所述2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白包括seta和/或mdfa；所述岩藻糖的转运蛋白包括fucp和/或emrd。

3.如权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于，所述2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白seta的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白mdfa的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4.如权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于，所述岩藻糖的转运蛋白fucp为来源于大肠杆菌k-12的外源转运蛋白，所述转运蛋白fucp的氨基酸序列如seq id no.3所示。

5.如权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于，所述岩藻糖的转运蛋白emrd为内源转运蛋白，所述转运蛋白emrd的氨基酸序列如seq id no.4所示。

6.如权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌以大肠杆菌fuc001为底盘菌株通过将2’-岩藻糖基乳糖的转运蛋白敲除或敲减，将整合后的外源岩藻糖转运蛋白或内源岩藻糖的转运蛋白的天然启动子替换为强启动子制备得到。

7.如权利要求1-6任一项所述大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，当所述岩藻糖的转运蛋白为fucp时，所述步骤s2的操作如下：构建带有强启动子编码序列和fucp蛋白编码序列的表达盒，将表达盒片段克隆至表达载体中并转化至步骤s1所得大肠杆菌a中，得到高产岩藻糖的大肠杆菌。

9.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌fuc001主要由以下步骤制备得到：

10.如权利要求1-6任一项所述的大肠杆菌在生产岩藻糖中的应用。

技术总结本申请涉及微生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种高产岩藻糖的大肠杆菌及其构建方法和应用。本申请提供了一种高产岩藻糖的大肠杆菌，所述大肠杆菌敲除2’‑岩藻糖基乳糖的转运蛋白和过表达岩藻糖的转运蛋白；所述2’‑岩藻糖基乳糖的转运蛋白包括SetA和/或MdfA；所述岩藻糖的转运蛋白包括FucP和/或EmrD。本申请提供了一种高产岩藻糖的大肠杆菌，在大肠杆菌的基因组中整合了带有强启动子的外源FUC转运蛋白FucP或替换为强启动子的内源转运蛋白EmrD，同时敲除了2’‑FL转运蛋白SetA和/或MdfA，能够使2’‑FL的残留量下降，使FUC的产量提高，效果十分显著，具有较高的应用价值。技术研发人员：吴金勇,夏子涵,陈祥松,袁丽霞,姚建铭受保护的技术使用者：合肥中科健康生物产业技术研究院有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/14