葡萄牙棒孢酵母在制备γ-癸内酯中的应用以及γ-癸内酯的制备方法

本发明涉及化合物合成，尤其涉及葡萄牙棒孢酵母在制备γ-癸内酯中的应用以及γ-癸内酯的制备方法。

背景技术：

1、γ-癸内酯(γ-decalactone，gdl)是一种具有桃香和椰子香的高价值手性香料化合物，广泛用于食品、化妆品及香水中。γ-癸内酯的两种手性对映体具有完全不同的风味特征。目前，γ-癸内酯主要通过化学合成或微生物发酵法生产。化学合成法虽然工艺成熟，但存在环境污染和光学异构体选择性差的问题。而传统的微生物发酵法则需要在培养过程中添加额外的碳源和氮源以供微生物生长，同时要求严格的无菌条件以防污染，这些因素均增加了生产成本与操作复杂性。此外，微生物发酵法还存在副产物多、底物和产物对微生物生长的毒性抑制等问题。因此，开发一种高效、环境友好且能产生高光学纯度的γ-癸内酯的新方法成为本领域技术人员的研究热点。

2、全细胞催化法是基于微生物细胞的另一种生物催化技术，可弥补发酵法的缺点，具有反应条件温和、高选择性、污染和成本低、副产物少等优势。然而，目前还未有关于全细胞催化制备γ-癸内酯的研究报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供葡萄牙棒孢酵母在制备γ-癸内酯中的应用以及γ-癸内酯的制备方法。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了葡萄牙棒孢酵母在制备γ-癸内酯中的应用，所述葡萄牙棒孢酵母为葡萄牙棒孢酵母(clavispora lusitaniae)yj26，其保藏编号为gdmcc no:62906；该菌株已于2022年10月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州先烈中路100号。

4、本发明通过研究发现，葡萄牙棒孢酵母(clavispora lusitaniae)yj26作为全细胞催化剂能够催化蓖麻油酸合成γ-癸内酯，相比于其他的酵母菌作为全细胞催化剂，葡萄牙棒孢酵母(clavispora lusitaniae)yj26全细胞催化剂具有更高的催化效率，能够制备得到产量更高的γ-癸内酯。

5、作为本发明所述应用的优选实施方式，葡萄牙棒孢酵母的菌体在制备γ-癸内酯中的应用。本发明利用葡萄牙棒孢酵母(clavispora lusitaniae)yj26的菌体作为全细胞催化剂，菌体含有该菌完整的细胞。

6、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述菌体的制备方法为：葡萄牙棒孢酵母接种于培养基中扩大培养，离心收集沉淀，洗涤后的沉淀即所述菌体。

7、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述扩大培养利用的培养基为ypd培养基。

8、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述扩大培养的条件为28～30℃，150～200r/min，培养20～24h。

9、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述扩大培养的条件为28℃，180r/min，培养24h。

10、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述离心的条件为：2～6℃和8000～12000r/min条件下离心10～15min。

11、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述离心的条件为：4℃和10000r/min条件下离心10min；所述洗涤为：用去离子水洗涤；优选地，洗涤两遍。

12、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述γ-癸内酯的立体构型为r-构型；所述γ-癸内酯的旋光性为右旋。

13、第二方面，本发明提供了一种γ-癸内酯的制备方法，其包括以下步骤：

14、s1、对葡萄牙棒孢酵母进行扩大培养，离心、洗涤并收集沉淀，得到全细胞催化剂；所述葡萄牙棒孢酵母为葡萄牙棒孢酵母(clavispora lusitaniae)yj26，该菌株已于2022年10月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:62906，保藏地址为广东省广州先烈中路100号；

15、s2、将蓖麻油酸、表面活性剂、全细胞催化剂加入去离子水中，混匀后的混合物于20～40℃，120～220r/min条件下反应72～360h，离心去除全细胞催化剂，即得γ-癸内酯；所述混合物中蓖麻油酸的终浓度为50～350mmol/l，表面活性剂的终浓度为10～80mmol/l，全细胞催化剂的终浓度为5～100g/l。

16、本发明利用葡萄牙棒孢酵母(clavispora lusitaniae)yj26的菌体作为全细胞催化剂，利用吐温-80、吐温40、吐温-60等作为表面活性剂，将蓖麻油酸与反应体系充分混匀，催化蓖麻油酸经过脂肪酸的β-氧化作用和环化作用最终转化成γ-癸内酯。本发明利用特定的条件，使制备得到γ-癸内酯产量达到1.75g/l以上，可达8.25g/l。

17、本发明步骤s2的混合物反应结束后，离心去除全细胞催化剂，得到含有γ-癸内酯的上清液，可利用正己烷等有机溶剂萃取出γ-癸内酯，去除有机溶剂，即得到初步纯化的γ-癸内酯。具体地，反应结束后，将上清液与正己烷以体积比1:1混合，使上清液中的γ-癸内酯萃取到正己烷相中，利用气相色谱法可测定正己烷相中γ-癸内酯的浓度和对映体过量值(e.e.)，去除正己烷，即可得到初步纯化的γ-癸内酯。

18、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s1中，所述扩大培养利用的培养基为ypd培养基；所述扩大培养的条件为：28～30℃，150～200r/min，培养20～24h；所述离心的条件为：2～6℃，8000～12000r/min条件下离心10～15min；所述洗涤是用去离子水洗涤，优选的洗涤两遍。

19、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s1中，所述扩大培养利用的培养基为ypd培养基；所述扩大培养的条件为：28℃，180r/min，培养24h；所述离心的条件为：4℃，10000r/min条件下离心10min。

20、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s2中，所述表面活性剂包括吐温-80、吐温40或吐温-60。优选地，所述表面活性剂为吐温-80。

21、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s2中，所述混合物于25℃，200r/min条件下反应288h。该条件下，γ-癸内酯的产量更高。

22、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s2中，所述混合物中蓖麻油酸的终浓度为50～250mmol/l，表面活性剂的终浓度为10～40mmol/l，全细胞催化剂的终浓度为5～15g/l。该条件下，γ-癸内酯的产量更高。

23、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s2中，所述混合物中蓖麻油酸的终浓度为250mmol/l，表面活性剂的终浓度为40mmol/l，全细胞催化剂的终浓度为15g/l。该条件下，γ-癸内酯的产量最高。

24、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s2中，所述离心的条件为：2～6℃和8000～12000r/min条件下离心10～15min。该离心条件能够将反应体系中的全细胞催化剂充分离心沉淀，进而充分去除。

25、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s2中，所述离心的条件为：4℃和10000r/min条件下离心10min。

26、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述制备方法还包括以下步骤：

27、s3、步骤s2的混合物反应结束后，离心，取上清液调节ph值至1.0～3.0，充分反应，即得γ-癸内酯。

28、本发明利用酸性条件进一步催化γ-癸内酯的合成，将全细胞催化剂与化学催化相结合，达到了增加γ-癸内酯产量的目的，最终合成的(r)-(+)-γ-癸内酯产量可达到11.42g/l。

29、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s3中，所述充分反应的条件为：反应温度30～80℃，反应时间25～85min。

30、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s3中，所述调节ph值利用的酸包括：磷酸、盐酸、乳酸、甲酸、乙酸或柠檬酸。

31、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s3中，所述调节ph值利用的酸包括：盐酸或乙酸。

32、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤s3中，所述调节ph值利用的酸是盐酸。该条件下，γ-癸内酯的产量更高。

33、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述γ-癸内酯的立体构型为r-构型；所述γ-癸内酯的旋光性为右旋。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

35、本发明利用葡萄牙棒孢酵母作为全细胞催化剂在水相介质中催化蓖麻油酸转化制备γ-癸内酯。与传统的微生物发酵法相比，本发明的方法节省了发酵法中必需的碳源和氮源的添加，以及严格的无菌处理等步骤，减少了副产物的产生以及底物、产物对微生物生长的毒性抑制，降低了生产成本和简化了操作流程。全细胞催化剂的高转化率和立体选择性也保证了γ-癸内酯的高产率和高光学纯度。同时，本发明将全细胞催化与化学催化相结合进一步增加了产物γ-癸内酯的产量。