一种基于细菌样颗粒的炭疽芽胞杆菌疫苗

本发明属于生物医药领域，涉及一种基于细菌样颗粒的炭疽芽胞杆菌疫苗。

背景技术：

1、乳酸乳球菌经热酸处理，可以将包括核酸在内的胞内组分全部清除，但是细胞壁肽聚糖基质却能完好保存。因此，得到的灭活颗粒仍保持了与处理前细菌相同的大小和形状，称为细菌样颗粒(bacteria-like particles,blp)，也可以称作革兰氏阳性增强基质(gram positive enhancer matrix，gem)。细菌样颗粒系统已经被可以开发成一种新型的疫苗抗原递送系统，用于疫苗抗原的呈递，而细菌样颗粒疫苗抗原递送系统的核心即为gem-pa系统。该系统主要由两部分组成：第一部分是锚钩蛋白(protein anchor，pa)，pa含有肽聚糖结合序列，可以非共价结合在肽聚糖上；pa与肽聚糖的亲和力高，只有经过sds或氯化锂处理才能将pa蛋白从肽聚糖上分离下来；第二部分是热的三氯乙酸处理的乳酸菌即gem颗粒，可以高效地结合pa融合蛋白。gem-pa系统作为一个良好的表面展示平台，具有操作简单的特点，简单来说，就是将pa与抗原蛋白融合表达，表达完成后的蛋白溶液和gem颗粒混合孵育，在锚定蛋白pa的牵引作用下，抗原蛋白能够高效地结合在gem颗粒上。

技术实现思路

1、本发明所要解决的主要问题是如何获得炭疽芽胞杆菌疫苗。

2、为了解决上述问题，本发明提供了细菌样颗粒。

3、本发明的细菌样颗粒，通过将含有炭疽芽胞杆菌抗原的融合蛋白展示到gem颗粒表面制备得到。

4、上述细菌样颗粒中，所述含有炭疽芽胞杆菌抗原的融合蛋白为融合蛋白a或融合蛋白b，

5、所述融合蛋白a由锚钩蛋白p60和所述炭疽芽胞杆菌的pa蛋白的第4结构域pad4融合而成；所述融合蛋白b由锚钩蛋白p60和所述炭疽芽胞杆菌的致死因子lf的pa结合结构域lfb融合而成。

6、进一步地，所述融合蛋白a的氨基酸序列可为如下任一所示：

7、a1)氨基酸序列为seq id no.3的蛋白质；

8、a2)将seq id no.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

9、a3)a1)或(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

10、a4)a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白a。

11、进一步地，所述融合蛋白b的氨基酸序列可为如下任一所示：

12、b1)氨基酸序列为seq id no.4蛋白质；

13、b2)将seq id no.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

14、b3)b1)或(b2)中任一所限定的氨基酸序列具有75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

15、b4)b1)-(b3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白b。

16、为了使a1)或b1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seq id no.3或seqid no.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

17、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

18、进一步地，所述融合蛋白a为p60-pad4，所述融合蛋白b为p60-lfb。

19、所述细菌样颗粒可为p60-lfb-gem或p60-pad4-gem，所述p60-pad4-gem中所述p60-pad4与gem颗粒的配比可为：30μg以上的所述p60-pad4蛋白对应一个单位的gem颗粒(2.5×109个)；所述p60-lfb-gem中所述p60-lfb与gem颗粒的配比可为：30μg以上的所述p60-lfb蛋白对应一个单位的gem颗粒(2.5×109个)。

20、所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。

21、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码融合蛋白a或融合蛋白b的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的融合蛋白a或融合蛋白b的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码融合蛋白a或融合蛋白b且具有融合蛋白a或融合蛋白b功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

22、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

23、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列或核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

24、本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

25、本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

26、进一步地，所述锚钩蛋白p60来源于单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)。

27、所述锚钩蛋白p60的氨基酸序列可为序列表中序列3中的第1位至218位或序列4中的第1位至218位。

28、前文所述的细菌样颗粒中的所述融合蛋白也属于本发明要求保护的范围。

29、本发明还提供了前文所述的细菌样颗粒在制备炭疽芽胞杆菌疫苗中的应用。

30、本发明还提供了前文所述的融合蛋白在制备炭疽芽胞杆菌疫苗中的应用。所述融合蛋白a的编码核苷酸可为如下：

31、c1)核苷酸序列是seq id no.1所示的dna分子；

32、c2)与c1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码前文所述融合蛋白a的dna分子；

33、c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码前文所述融合蛋白a的dna分子。

34、所述融合蛋白b的编码核苷酸可为如下：

35、d1)核苷酸序列是seq id no.2所示的dna分子；

36、d2)与d1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码前文所述融合蛋白b的dna分子；

37、d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码前文所述融合蛋白b的dna分子。

38、本发明还提供了一种炭疽芽胞杆菌疫苗，所述疫苗的活性成分包括前文所述的细菌样颗粒。

39、本发明中，所述疫苗活性成分包括多肽疫苗和蛋白质疫苗中的任意一种。

40、所述疫苗制剂包括：口服疫苗、静脉注射疫苗、动脉注射疫苗、粘膜给药疫苗、肌肉注射疫苗、皮下注射疫苗、器官注射疫苗和胸腹腔内注射疫苗中的任意一种或至少两种的组合。

41、本发明中，所述疫苗中活性成分具体可为所述细菌样颗粒p60-lfb-gem或p60-pad4-gem。

42、所述p60-lfb-gem与p60-pad4-gem按1:1的比例混合，此时gem浓度为100u/ml。

43、本发明中，所述gem为乳酸乳球菌1936菌体使用10％的三氯乙酸处理后得到的gem颗粒。

44、本发明还提供了前文所述的细菌样颗粒，或所述的融合蛋白，或所述的炭疽芽胞杆菌疫苗在制备治疗或预防感染炭疽芽胞杆菌的疾病的药物中的应用。

45、本发明利用来自单增李斯特菌的p60蛋白的肽聚糖结合结构域，融合炭疽杆菌的抗原蛋白，构建了一种基于细菌样颗粒的炭疽杆菌疫苗。实验表明本发明的炭疽杆菌疫苗具有良好的免疫原性和保护性，可用于新型炭疽疫苗的研究与开发。