一种变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株及其构建方法和应用

本发明属于生物工程，尤其涉及一种变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、假单胞菌属(pseudomonas)细菌的细胞质膜上具有pqq依赖的葡萄糖脱氢酶和fad依赖的葡萄糖酸脱氢酶，能够在细胞的周质空间中高效地氧化葡萄糖为葡萄糖酸，并进而氧化葡萄糖酸为2-酮基葡萄糖酸(2-ketogluconic acid,2kga)。同时，假单胞菌通常具有适应不同理化环境和营养环境、显著耐受内源性和外源性胁迫等特征，因而在2kga的工业发酵生产中得到了普遍采用。2kga具有广泛的工业用途，其中最为重要的用途是作为抗氧化剂d-异抗坏血酸及其盐类合成的前体。

2、根据生化反应在细胞中的定位，假单胞菌的葡萄糖代谢可分为两类途径，即胞外氧化途径和胞内磷酸化途径。由于葡萄糖的氧化过程发生于细胞的周质空间且氧化的最终产物为2kga，因而该代谢途径被称为假单胞菌的葡萄糖胞外氧化途径或2kga的合成途径。与胞外氧化途径相对应，假单胞菌的葡萄糖胞内磷酸化途径包含了来源于周质空间的葡萄糖、葡萄糖酸和2kga在细胞质中的磷酸化及磷酸化产物分解代谢的一系列生化反应。

3、在特定的发酵体系环境下，假单胞菌葡萄糖代谢的胞外氧化途径与胞内磷酸化途径的代谢通量始终保持着一种动态平衡，即2kga的发酵产率(糖酸转化率)保持相对稳定。如何对假单胞菌胞内磷酸化途径进行弱化以进一步提高假单胞菌发酵生产2kga的发酵生产性能是目前需要解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株及其构建方法和应用，本发明的变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株发酵生产2kga的发酵生产性能优良。

2、本发明提供了敲除或沉默edd基因的片段的试剂在促进变形假单胞菌生物合成2-酮葡萄糖酸盐中的应用；所述edd基因片段至少包含seq id no.3所示核苷酸序列。

3、优选的，所述变形假单胞菌包括变形假单胞菌jsu01；所述变形假单胞菌jsu01的保藏编号为cgmcc no.7150。

4、优选的，所述敲除或沉默edd基因的片段的试剂包括引物组；所述引物组包括引物p1、p2、p3和p4；所述引物p1、p2、p3和p4的核苷酸序列分别如seq id no.4～seq id no.7所示。

5、本发明还提供了一种变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株，是在变形假单胞菌(pseudomonasplecoglossicida)jsu01的基础上敲除或沉默edd基因或者敲除或沉默edd基因的片段序列得到的；所述edd基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述变形假单胞菌jsu01的保藏编号为cgmcc no.7150。

6、优选的，所述edd基因片段至少包含seq id no.3所示核苷酸序列。

7、本发明还提供了上述方案所述变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株的构建方法，包括以下步骤：将线性化的pk18mobsacb与edd基因上下游同源臂融合片段进行连接，得到重组自杀质粒；所述edd基因上下游同源臂融合片段的核苷酸序列如seq idno.8所示；将所述重组自杀质粒转入变形假单胞菌jsu01的感受态细胞后，涂布于含有50μg/l卡那霉素的lb固体培养基上培养，得到带有卡那霉素抗性基因的重组菌株；将所述的带有卡那霉素抗性基因的重组菌株涂布于含有0.1g/ml蔗糖的lb固体培养基上，进行培养，得到变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株。

8、本发明还提供了上述方案所述的变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株或者所述构建方法构建得到的变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株在发酵生产2-酮葡萄糖酸盐中的应用。

9、优选的，所述发酵生产2-酮葡萄糖酸盐包括以下1)～3)中的一个或几个方面：1)提高发酵生产2-酮葡萄糖酸盐的产量；2)提高发酵生产2-酮葡萄糖酸盐的糖酸转化率；3)提高发酵生产2-酮葡萄糖酸盐的发酵生产强度。

10、本发明还提供了一种发酵生产2-酮葡萄糖酸盐的方法，包括以下步骤：

11、将上述方案所述的变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株或者所述构建方法构建得到的变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株的种子液接种于发酵培养基，进行发酵，得到含有2-酮葡萄糖酸盐的发酵产物。

12、优选的，所述发酵的温度为30～36℃。

13、本发明提供了敲除或沉默edd基因的片段的试剂在促进变形假单胞菌生物合成2-酮葡萄糖酸盐中的应用；所述edd基因片段至少包含seq id no.3所示核苷酸序列。变形假单胞菌(pseudomonasplecoglossicida)jsu01是目前国内2kga发酵的工业生产菌株之一，其对葡萄糖的发酵转化率接近理论转化率的90％。本发明在变形假单胞菌jsu01的基础上敲除edd基因的片段得到变形假单胞菌jsu01δedd。与jsu01菌株不同，该突变株不能分解代谢发酵目标产物2kga，且其在30～36℃的温度范围内具有更为优良的2kga发酵生产性能。

14、生物保藏说明

15、变形假单胞菌(pseudomonasplecoglossicida)jsu01，于2013年1月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.7150。

技术特征：

1.敲除或沉默edd基因的片段的试剂在促进变形假单胞菌生物合成2-酮葡萄糖酸盐中的应用；所述edd基因片段至少包含seq id no.3所示核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述变形假单胞菌包括变形假单胞菌jsu01；所述变形假单胞菌jsu01的保藏编号为cgmccno.7150。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述敲除或沉默edd基因的片段的试剂包括引物组；所述引物组包括引物p1、p2、p3和p4；所述引物p1、p2、p3和p4的核苷酸序列分别如seq id no.4～seq id no.7所示。

4.一种变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株，其特征在于，是在变形假单胞菌(pseudomonasplecoglossicida)jsu01的基础上敲除或沉默edd基因或者敲除或沉默edd基因的片段序列得到的；

5.根据权利要求4所述的变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株，其特征在于，所述edd基因片段至少包含seq id no.3所示核苷酸序列。

6.权利要求4或5所述变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.权利要求4或5所述的变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株或者权利要求6所述构建方法构建得到的变形假单胞菌6-磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株在发酵生产2-酮葡萄糖酸盐中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵生产2-酮葡萄糖酸盐包括以下1)～3)中的一个或几个方面：

9.一种发酵生产2-酮葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30～36℃。

技术总结本发明提供了一种变形假单胞菌6‑磷酸葡萄糖酸脱水酶缺失突变株及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明在变形假单胞菌JSU01的基础上敲除edd基因的片段得到变形假单胞菌JSU01Δedd。与JSU01菌株不同，该突变株不能分解代谢发酵目标产物2‑酮基葡萄糖酸(2KGA)，且其在30～36℃的温度范围内具有更为优良的2KGA发酵生产性能。技术研发人员：孙雷,孙文敬,张倩楠,周强,崔凤杰,昝新艺,齐向辉受保护的技术使用者：江苏大学技术研发日：技术公布日：2024/11/4