单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法与流程

本申请属于基因测序，具体涉及一种单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法。

背景技术：

1、荧光标记核酸碱基识别测序方法是一种利用荧光标记的核苷酸(dntps)来识别dna或rna序列中的碱基的技术。荧光标记：特定的核苷酸(dntps)被标记上不同的荧光分子，每种荧光分子在受到特定波长的光激发时会发出特定颜色的光。测序反应：在测序过程中，dna聚合酶催化dntps在模板链上逐个添加到正在合成的dna链上。只有与模板链碱基配对正确的dntps才能被添加到合成链上。碱基识别：当一个荧光标记的dntp被添加到合成链上时，它会发出特定的荧光信号。通过检测这些信号，可以识别出合成链上新添加的碱基类型。信号采集：使用高分辨率成像系统来采集每个合成周期中发出的荧光信号。数据处理：荧光信号被转换成电信号，然后通过特定的软件进行分析，将信号转换为数字信息，从而确定dna链上的碱基序列。循环过程：上述过程在每个待测位点重复进行，直到整个目标序列被测定。

2、传统技术中的四色、双色都需要双色激光器进行两次曝光，但是激光照射会造成测序dna损伤，影响测序质量，测序过程需要尽量减少激光照射，而且四色的光路系统复杂，仪器成本高。而对于传统单色测序，虽然是单色激光器，但是仍需进行两次激光曝光和两轮拍照，测序流程复杂时间长，而且和四色或者双色一样造成dna损伤。

技术实现思路

1、基于此，本申请一实施例提供一种单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，该方法仅需单次激发进行单次曝光即可实现核苷酸的测序识别。

2、本申请一方面提供一种单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，包括：

3、提供核苷酸，所述核苷酸中与测序模板待测位点配对的核苷酸、测序模板、测序引物、核酸聚合酶和dntp反应，形成动态五元络合物；

4、所述dntp带有不同的受体标记且带有相同的供体标记；所述受体标记和所述供体标记能够被单激发光激发；

5、通过单激发单曝光后，采集信号，根据不同的发射波长确定待测位点的核苷酸种类。

6、在其中一个实施例中，所述受体标记包括受体染料；

7、可选地，所述受体染料包括rhodamine、texasred、cy5、liz、alexafluor700和h7中的一种或多种。

8、在其中一个实施例中，所述供体标记包括采用供体染料标记。

9、可选地，所述供体染料包括6-fam、pe、percp和apc中的一种或多种。

10、在其中一个实施例中，采用带通滤波器采集信号。

11、可选地，所述带通滤波器的滤光种类为1种～5种，且与dntp所含种类相对应。

12、在其中一个实施例中，当所述动态五元络合物为四色动态五元络合物时，四种dntp形成四种不同的发射光谱。

13、所述带通滤波器的滤光种类为四种，根据四种不同的发射波长进行核苷酸的识别。

14、在其中一个实施例中，当所述动态五元络合物为三色动态五元络合物时，四种dntp形成三种不同的发射光谱。

15、所述带通滤波器的滤光种类为三种，根据三种发射波长以及一种不发光核苷酸进行核苷酸识别。

16、在其中一个实施例中，当所述动态五元络合物为双色动态五元络合物时，四种dntp形成两种不同的发射光谱。

17、所述带通滤波器的滤光种类为两种，根据两种发射波长以及一种不发光核苷酸进行核苷酸识别。

18、在其中一个实施例中，所述dntp还使用两种不同的荧光标记进行标记，分别为第一荧光标记和第二荧光标记，第一荧光标记和第二荧光标记能被同一种激发光激发；根据发射光谱差异进行核苷酸识别。

19、在其中一个实施例中，所述第一荧光标记和第二荧光标记各自独立地选自coumarin derivatives、pyrenederivatives、acridinium rhodamine、fluoresceinderivatives、cyanine、pyrrole和fretdyes系列染料中的一种或者多种。

20、在其中一个实施例中，所述核酸聚合酶包括taq dna聚合酶、kod dna聚合酶和klenow酶中的一种或多种。

21、本申请的一个或多个实施例细节在下面的描述中提出，本申请的其他特征、目的和优点将从说明书及其权利要求书变得明显。

技术特征：

1.一种单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，所述受体标记包括受体染料；

3.根据权利要求1所述的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，所述供体标记包括采用供体染料标记；

4.根据权利要求1～3任一项所述的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，采用带通滤波器采集信号；

5.根据权利要求4所述的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，当所述动态五元络合物为四色动态五元络合物时，四种dntp形成四种不同的发射光谱；

6.根据权利要求4所述的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，当所述动态五元络合物为三色动态五元络合物时，四种dntp形成三种不同的发射光谱；

7.根据权利要求4所述的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，当所述动态五元络合物为双色动态五元络合物时，四种dntp形成两种不同的发射光谱；

8.根据权利要求7所述的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，

9.根据权利要求8所述的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，所述第一荧光标记和第二荧光标记各自独立地选自coumarin derivatives、pyrenederivatives、acridinium rhodamine、fluoresceinderivatives、cyanine、pyrrole和fretdyes系列染料中的一种或者多种。

10.根据权利要求1～3以及5～9中任一项所述的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法，其特征在于，所述核酸聚合酶包括taq dna聚合酶、kod dna聚合酶和klenow酶中的一种或多种。

技术总结本申请属于基因测序技术领域，具体涉及一种单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法。本申请提供的单激发单曝光荧光标记核苷酸识别测序方法通过特定设计dNTP带有不同的受体标记试剂且带有相同的供体标记试剂，通过单激发单曝光后，采用滤波器采集信号，确定待测位点的核苷酸种类。本申请仅需单个激光器并且进行单次曝光即可实现对待测核苷酸的检测，通过单次激发和单次曝光，可以减少DNA样本受激光的损伤，避免了多次激发和曝光间的样本信号抖动，以及引入的噪声和误差。有助于提升测序准确性和可靠性。技术研发人员：刘金枝,李汉东,徐洪受保护的技术使用者：深圳市大道测序生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/4