一种副猪嗜血杆菌5型GD1022株外膜囊泡及其制备方法与应用与流程

本发明涉及副猪嗜血杆菌外膜囊泡制备及疫苗制备，更具体的说是涉及一种副猪嗜血杆菌5型gd1022株外膜囊泡及其制备方法与应用。

背景技术：

1、近年来，副猪嗜血杆菌所引起的全身性炎性疾病给养猪业造成巨大的经济损失，如何预防和控制副猪嗜血杆菌病发生成为关注的焦点，疫苗的研究开发也受到了重视。

2、外膜囊泡(omvs)是革兰氏阴性菌表面分泌的产物，是细菌外膜在一定的机制下发生出芽并在细菌表面形成一种囊泡状的结构，这种结构包括了外膜以及周质成分。外膜囊泡大多数为球形，直径大约在20～250nm之间。1959年，de等首次发现霍乱弧菌滤除细菌后的培养液能够诱导家兔对霍乱弧菌的免疫反应。chatterje等在研究对数生长期霍乱弧菌的超微结构时，发现在液体培养基无菌滤液中有革兰氏阴性菌细胞壁出芽形成的囊泡，而且在外膜容易发生囊泡出芽的位点附近，颗粒物质含量较高，这些颗粒可以随着细胞质进入出芽的囊泡中。omvs的产生代表着细菌具有向外部环境释放大量的、复杂的蛋白组分和磷脂的独特机制。后来的研究发现，几乎所有的革兰氏阴性菌都能产生omvs，其化学结构的组成成分除了外膜蛋白还有其他一些膜结构成分，所以人们将这种膜结构的囊泡称为外膜囊泡。

3、随着公共卫生的进步，细菌感染发生有所降低，但细菌感染仍然是导致人类生病和死亡的主要原因之一。由于耐药菌的增加和快速传播，抗生素治疗细菌性疾病的有效性受到了挑战。因此，疫苗被认为是后抗生素时代应对细菌性疾病最直接有效的策略。高效的疫苗必然具备三大因素，(1)抗原：能够触发免疫反应，产生免疫记忆，防止机体受到进一步的攻击。(2)佐剂：保证免疫反应足够强大。(3)具有一定的安全性。

4、omvs中包含的外膜组分可以刺激机体产生适应性免疫记忆，含有的lps可作为自身佐剂，而且作为非复制性疫苗具一定安全性。所以这些因素促使omvs成为开发非复制性高效疫苗的热门选择。

5、现外膜囊泡多使用超速离心机进行两次超离心来进行提取，因超速离心机处理样品量有限，且操作难度大、成本高，费时费力，不能大量提取外膜囊泡，不适用于产业化生产，而本发明克服了此缺陷，本发明使用中空纤维浓缩系统对样品进行浓缩，可实现大量提取外膜囊泡，同时使用peg浓缩代替两次超速离心，即降低了成本又降低了操作难度，使外泌体的大量提取及产业化成为可能。

6、目前对副猪嗜血杆菌感染的发病机制的了解较为有限，预防措施仍不能完全控制该病的发生，使得副猪嗜血杆菌病成为养猪行业中的一个重大问题。副猪嗜血杆菌病的控制通常用抗菌药物治疗和疫苗接种的方法。然而，据报道，副猪嗜血杆菌临床分离株对抗生素表现出抗性，因此，疫苗接种和免疫抗体(igg或iga)通常被认为是控制副猪嗜血杆菌病的有效手段。但是，由于副猪嗜血杆菌的血清型较多，且还有很大比例的菌株没有分型，因此高效交叉保护疫苗的研制存在极大的困难。许多疫苗的作用和研究仍具有局限性。目前已经报道的副猪嗜血杆菌疫苗种类有灭活疫苗、亚单位疫苗、dna疫苗和减毒疫苗等。目前，全球在防控副猪嗜血杆菌病的过程中使用的商品化疫苗只有灭活疫苗、亚单位疫苗。虽然接种已报道的疫苗能降低死亡率，但由于其保护效果低或交叉保护性差，疫苗免疫失败也很常见。外膜囊泡(omvs)具有介导dna片段、自溶酶、细胞毒素、毒力因子和多种生物分子转移的特性，omvs的组成使其成为激活宿主先天和获得性免疫应答通路的重要因子。除了强大的免疫调节分子lps外，外膜囊泡还含有om孔蛋白和其他重要的先天免疫激活配体，omvs的免疫原性可导致保护性黏膜和全身杀菌抗体反应，已被用于疫苗开发。目前所有实验证据表明，对omvs的先天免疫反应是由细菌相关分子模式(pamps)和对lps的识别共同作用的结果。囊泡中的脂蛋白和om蛋白是一种生物活性分子，可以激活免疫细胞并诱导白细胞迁移。

7、综上，如何提供一种免疫效果好、有良好的交叉免疫性、避免耐药性、制备工艺简单的副猪嗜血杆菌疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种副猪嗜血杆菌5型gd1022株外膜囊泡及其制备方法与应用。本发明可利用副猪嗜血杆菌外膜囊泡制备成疫苗，旨在增强免疫效果，提高动物保护率，避免细菌耐药性造成的细菌病难以控制的现状，实现对副猪嗜血杆菌病的有效预防。本发明使用中空纤维浓缩系统进行浓缩，可实现大量提取外膜囊泡，同时使用peg浓缩代替两次超速离心，既降低了成本又降低了操作难度，使外泌体的大量提取及产业化成为可能。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种副猪嗜血杆菌5型gd1022株外膜囊泡，所述外膜囊泡为血清型5型副猪嗜血杆菌gd1022分泌；

4、所述副猪嗜血杆菌gd1022，其分类命名为副猪嗜血杆菌haemophilusparasuis，于2017年07月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno.14419，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

5、作为优选的技术方案，所述外膜囊泡具有双层膜结构的囊泡状小体，携带细菌外膜和周质成分，包括酶、毒力因子、细菌特异性抗原和多种病原相关分子模式。其中外膜组分可以刺激机体产生适应性免疫记忆，含有的lps可作为自身佐剂，而且作为非复制性疫苗具一定安全性，囊泡还含有om孔蛋白和其他重要的先天免疫激活配体。

6、作为优选的技术方案，所述外膜囊泡粒径在200nm以内，蛋白条带大小集中在25kda～200kda。

7、优选地，omvs的组成使其成为激活宿主先天和获得性免疫应答通路的重要因子。除了强大的免疫调节分子lps外，囊泡还含有om孔蛋白和其他重要的先天免疫激活配体。

8、本发明的另一目的是，提供上述副猪嗜血杆菌外膜囊泡的制备方法。

9、上述的外膜囊泡的制备方法，将副猪嗜血杆菌血清型5型gd1022株经菌体培养、离心取上清、300kd中空纤维柱过滤、peg处理、重悬后过0.22μm滤膜即可。

10、作为优选的技术方案，具体步骤如下：

11、(1)将血清型5型副猪嗜血杆菌gd1022经发酵罐通气单独培养，培养到稳定期，得到菌液；

12、(2)将菌液10000rpm，2～8℃，离心10min，取上清过300kd中空纤维系统浓缩，得到浓缩液；

13、(3)向浓缩液中按7％的量加入peg，2～8℃下搅拌4h后，2～8℃静置过夜，第二天，经12000rpm离心30min，将沉淀用pbs重悬过0.22μm滤膜，得副猪嗜血杆菌外膜囊泡。

14、进一步的，所述步骤(1)中培养条件为：溶氧为33～36％；37℃培养10～12小时；所用培养基为tsb，其中加入终浓度为4μg/ml的nad和5％的新生牛血清。

15、一种预防副猪嗜血杆菌病的疫苗，包括权利要求1～3任一所述的外膜囊泡。

16、进一步的，所述外膜囊泡的浓度为0.05～20mg/ml。

17、上述的外膜囊泡、上述制备方法制备的外膜囊泡在制备预防/治疗副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。

18、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明首次将副猪嗜血杆菌外膜囊泡作为疫苗免疫动物，通过动物试验证明本发明副猪嗜血杆菌外膜囊泡具有显著预防副猪嗜血杆菌病的效果，可用于制备预防副猪嗜血杆菌病的产品，从而应用于预防副猪嗜血杆菌病、避免细菌耐药性，具备良好的实际应用价值。