灰比诺葡萄病毒变种侵染性克隆及其构建方法与应用

本发明涉及生物，具体涉及灰比诺葡萄病毒变种侵染性克隆及其构建方法与应用。

背景技术：

1、灰比诺葡萄病毒（gpgv）是乙型线状病毒科（ betaflexiviridae）的纤毛病毒属（ trichovirus）的成员之一，是2012年在意大利北部的灰比诺葡萄上首次发现的，被认为是葡萄花叶和变形病（grapevine leaf mottling and deformation，glmd）的致病因子。gpgv会引起葡萄叶片斑驳、皱缩和变形、葡萄果穗数减少、果粒重降低、成熟延迟和酸度增高。目前，gpgv已在世界上的58个国家被报道。2016年，该病毒在我国首次报道，并初步表明gpgv与葡萄褪绿花叶症状的发生相关，且常用作砧木的贝达葡萄对gpgv较为敏感。2018年，对来自我国15个省区市的195个葡萄样品进行检测，结果显示gpgv检出率为28.2%。gpgv可通过葡萄瘿螨进行传播，且该病毒在田间存在草本寄主，有研究者认为灰比诺葡萄病毒比葡萄扇叶病毒危害更大。作为一种发生普遍，危害严重的葡萄病毒，有必要对其致病性进行深入研究，为其危害规律及综合防控技术研究提供理论依据。开展病毒致病性研究，对于今后病毒病的防控至关重要。

2、目前，gpgv致病性研究是国内外葡萄病毒学研究的热点。gpgv是一个+ssrna病毒，其基因组全长约7259 bp，由3个重叠的开放阅读框组成，分别编码复制酶（replicase，rp），移动蛋白（movement protein，mp）和外壳蛋白（coat protein，cp）。saldarelli等人的研究结果表明，一些gpgv分离物由于mp基因3’端发生snp突变，导致编码mp蛋白的基因提前终止，而编码较短mp蛋白基因的gpgv分离物一般具强致病性，可引起明显的症状。但是，后来其他研究者的结果并不完全支持这一观点。本技术发明人2018年对我国gpgv分离物进行基因变异研究时，发现gpgv分离物bj-cas1具有mp终止密码子uaa，编码较短的mp，但该样品并未表现明显症状。因此，gpgv mp基因上发生的snp突变与严重症状的发生的对应关系需进一步明确。

3、侵染性克隆作为反向遗传学研究的一种技术手段，便于从dna水平上操作研究病毒的致病性及病毒与病害的关系。因此，构建重要病毒的侵染性克隆，在植物病毒致病性的研究中十分重要。病毒侵染性克隆的构建是将病毒全长cdna片段插入到来源花椰菜花叶病毒（camv）的35s强力启动子的下游，从而启动病毒cdna在真核植物中转录，获得具有侵染性的病毒rna。采用侵染性克隆接种无病毒植物，可明确病毒与植物病害之间的关系。前人已报道gpgv的致病力可能与gpgv滴度、不同品种的抗性有关。

4、虽然giulia tarquini 等人在2019年首次构建了两个gpgv侵染性cdna克隆（参考文献agroinoculation of grapevine pinot gris virus intobacco and grapevineprovides insights onviral pathogenesis，plos one，2019年，第14卷，第3期），但giuliatarquini 等人用于构建侵染性克隆的两个gpgv分离物fvg-is12（accession mh087443）和fvg-is15（accession mh087446）序列相近，同源性为96.95%，且位于同一个系统进化分支，亲缘关系较近。fvg-is12和fvg-is15虽然分别从有症状和无症状的葡萄中扩增到，但构建的两个侵染性克隆pri::gpgv-vir和pri::gpgv-lat在接种葡萄后产生的症状相似。并且，giulia tarquini 等人构建gpgv时并未获得完整的gpgv基因组全长序列，这可能对gpgv真实的致病性具有一定影响。由此可见，giulia tarquini 等人构建的gpgv侵染性克隆pri::gpgv-vir和pri::gpgv-lat并不具有致病力分化，进而推测mp基因3’端的snp可能不一定与致病性强弱相关。目前尚无研究报道同源性差异较大且位于不同进化分支的gpgv变种之间的致病性差异。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供致病力差异较大的灰比诺葡萄病毒变种侵染性克隆及其构建方法与应用。

2、为了实现上述目的，本发明首先提供了灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆。

3、本发明提供的灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆为含有灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列的植物表达载体；所述灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列如序列表中序列2或序列1所示。

4、上述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆中，所述植物表达载体还包括启动子，所述启动子的作用为启动所述灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列的表达。

5、上述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆中，所述植物表达载体还包括核酶（hdv-rz）基因，所述核酶基因的作用为当灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆于植物体内表达后，在合适的位置切下灰比诺葡萄病毒基因组。

6、在本发明的一个实施方案中，所述植物表达载体为pcb301-2x35s-hdvrz-nos载体。

7、在本发明的另一个实施方案中，所述植物表达载体为pcb301载体。

8、在本发明的一个优选实施方案中，所述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆为含有序列1所示的灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列的pcb301-2x35s-hdvrz-nos载体。

9、在本发明的另一个优选实施方案中，所述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆为含有序列2所示的灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列的pcb301载体。

10、为了实现上述目的，本发明又提供了灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆组合物。

11、本发明提供的灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆组合物包括灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆和灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆；

12、所述灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆为含有灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列的植物表达载体；所述灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列如序列表中序列1所示；

13、所述灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆为含有灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列的植物表达载体；所述灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列如序列表中序列2所示。

14、上述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆组合物中，所述植物表达载体还包括启动子，所述启动子的作用为启动所述灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列的表达。

15、上述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆组合物中，所述植物表达载体还包括核酶（hdv-rz）基因，所述核酶基因的作用为当灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆于植物体内表达后，在合适的位置切下灰比诺葡萄病毒基因组。

16、在本发明的一个实施方案中，所述植物表达载体为pcb301-2x35s-hdvrz-nos载体。

17、在本发明的另一个实施方案中，所述植物表达载体为pcb301载体。

18、在本发明的一个优选实施方案中，所述灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆为含有序列1所示的灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列的pcb301-2x35s-hdvrz-nos载体。

19、在本发明的另一个优选实施方案中，所述灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆为含有序列2所示的灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列的pcb301载体。

20、为了实现上述目的，本发明还提供了上述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆或上述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆组合物的制备方法。

21、本发明提供的上述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆包括如下步骤：将灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列的重组表达载体；所述重组表达载体即为灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆；所述灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列如序列表中序列2或序列1所示。

22、本发明提供的上述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆组合物的制备方法包括如下步骤：制备灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆和灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆；

23、所述制备灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆的方法包括如下步骤：将灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列的重组表达载体；所述重组表达载体即为灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆；所述灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列如序列表中序列1所示；

24、所述制备灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆的方法包括如下步骤：将灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列的重组表达载体；所述重组表达载体即为灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆；所述灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列如序列表中序列2所示。

25、上述方法中，所述将灰比诺葡萄病毒基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体为将灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体或将灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体。

26、在本发明的一个实施方案中，所述将灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体的方法包括如下步骤：以灰比诺葡萄病毒gp6的cdna为模板，通过长片段一步扩增获得灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列，然后通过无缝克隆试剂盒将灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列连接至植物表达载体中。

27、在本发明的一个优选实施方案中，所述将灰比诺葡萄病毒gp6基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体的方法包括如下步骤：

28、1）以灰比诺葡萄病毒gp6的cdna为模板，采用序列3和序列4所示的dna分子进行pcr扩增，得到gp6基因组全长序列；

29、2）以pcb301-2x35s-hdvrz-nos载体为模板，采用序列6所示的dna分子和序列8所示的dna分子进行线性化扩增，得到大小为4623 bp的线性化载体；

30、3）利用无缝克隆试剂盒将所述大小为4623 bp的线性化载体与所述gp6基因组全长序列进行连接，得到所述重组表达载体。

31、在本发明的另一个实施方案中，所述将灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体的方法包括如下步骤：以灰比诺葡萄病毒gp18的cdna为模板，通过长片段一步扩增获得灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列，然后通过无缝克隆试剂盒将灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列连接至植物表达载体中。

32、在本发明的另一个优选实施方案中，所述将灰比诺葡萄病毒gp18基因组全长cdna序列通过无缝克隆方式连接至植物表达载体的方法可包括如下步骤：

33、1）以灰比诺葡萄病毒gp18的cdna为模板，采用序列3和序列5所示的dna分子进行pcr扩增，得到gp18基因组全长序列；

34、2）以pcb301-2x35s-hdvrz-nos载体为模板，采用序列7所示的dna分子和序列8所示的dna分子进行线性化扩增，得到大小为4178 bp的线性化载体；

35、3）利用无缝克隆试剂盒将所述大小为4178 bp的线性化载体与所述gp18基因组全长序列进行连接，得到所述重组表达载体。

36、根据上述方法制备得到的灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆或根据上述制备得到的灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆组合物也属于本发明的保护范围。

37、为了实现上述目的，本发明还提供了重组菌或重组菌组合物；

38、所述重组菌为含有上述灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆的重组菌，具体为含有上述灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆的重组菌或含有上述灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆的重组菌。

39、所述重组菌组合物包括含有上述灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆的重组菌和含有上述灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆的重组菌，具体为由含有上述灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆的重组菌和含有上述灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆的重组菌组成。

40、在本发明的一个实施方案中，所述含有上述灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆的重组菌为含有上述灰比诺葡萄病毒gp6侵染性全长cdna克隆的农杆菌eha105。

41、在本发明的另一个实施方案中，所述含有上述灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆的重组菌为含有上述灰比诺葡萄病毒gp18侵染性全长cdna克隆的农杆菌eha105。

42、为了实现上述目的，本发明还提供了上述灰比诺葡萄病毒侵染性克隆或上述灰比诺葡萄病毒侵染性克隆组合物或根据上述方法制备得到的灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆或根据上述方法制备得到的灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆组合物或上述重组菌或重组菌组合物的新用途。

43、本发明提供了上述灰比诺葡萄病毒侵染性克隆或上述灰比诺葡萄病毒侵染性克隆组合物或根据上述方法制备得到的灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆或根据上述方法制备得到的灰比诺葡萄病毒侵染性全长cdna克隆组合物或上述重组菌或重组菌组合物在如下r1）-r8）任一种中的应用：

44、r1）制备构建单一病毒侵染植物模型的产品；

45、r2）构建单一病毒侵染植物模型；

46、r3）制备构建致病性不同或差异显著的侵染植物模型的产品；

47、r4）构建致病性不同或差异显著的侵染植物模型；

48、r5）制备研究灰比诺葡萄病毒生物学特性和/或致病性和/或致病机理的产品；

49、r6）研究灰比诺葡萄病毒生物学特性和/或致病性和/或致病机理；

50、r7）制备研究灰比诺葡萄病毒与宿主植物互作的产品；

51、r8）研究灰比诺葡萄病毒与宿主植物互作；

52、所述单一病毒为灰比诺葡萄病毒。

53、所述致病性不同或差异显著体现为如下t1）或t2）：

54、t1）gp6侵染性克隆侵染烟草后表现为叶片出现轻微的褪绿斑驳症状，而gp18侵染性克隆侵染烟草后表现为叶片出现坏死症状；

55、t2）gp6侵染性克隆侵染葡萄后表现为叶片出现轻微的褪绿驳症症状，而gp18侵染性克隆侵染葡萄后表现为植株矮小、顶芽枯死、叶片出现严重的褪绿斑驳症状。

56、上述任一所述植物或宿主植物为烟草（如西方烟）或葡萄（如贝达葡萄）。

57、上述序列1或序列2所示的灰比诺葡萄病毒全基因组序列以及用于扩增上述序列1或序列2所示的灰比诺葡萄病毒全基因组序列的引物对也属于本发明的保护范围。

58、所述用于扩增上述序列1所示的灰比诺葡萄病毒全基因组序列的引物对由序列3所示的dna分子和序列4所示的dna分子组成。

59、所述用于扩增上述序列2所示的灰比诺葡萄病毒全基因组序列的引物对由序列3所示的dna分子和序列5所示的dna分子组成。

60、为了实现上述目的，本发明最后提供了上述序列1或序列2所示的灰比诺葡萄病毒全基因组序列以及用于扩增上述序列1或序列2所示的灰比诺葡萄病毒全基因组序列的引物对在如下s1）-s8）中任一所述的应用：

61、s1）制备灰比诺葡萄病毒的检测和/或鉴定的产品；

62、s2）灰比诺葡萄病毒的检测和/或鉴定；

63、s3）制备检测或辅助检测待测病毒是否为灰比诺葡萄病毒的产品；

64、s4）检测或辅助检测待测病毒是否为灰比诺葡萄病毒；

65、s5）制备检测或辅助检测待测样品是否感染或携带灰比诺葡萄病毒的产品；

66、s6）检测或辅助检测待测样品是否感染或携带灰比诺葡萄病毒；

67、s7）制备灰比诺葡萄病毒的进化分析和/或分子流行病学研究的产品；

68、s8）灰比诺葡萄病毒的进化分析和/或分子流行病学研究。

69、本发明的有益效果：本发明通过pcr和race扩增获得了两个序列差异较大gpgv变种gp6和gp18的准确的基因组全长序列，通过比对发现它们之间的同源性较低，仅为82.89%，且位于不同的进化分支上。更为重要的是，本发明采用直接长片段扩增全基因组并无缝克隆于侵染性克隆载体中，成功构建了gp6和gp18的侵染性克隆，并通过分别接种西方烟和葡萄证明，gp6和gp18具有明显的致病力差异。本发明首次公开了灰比诺葡萄病毒gp6和gp18的基因组全长cdna序列，并采用侵染性克隆接种证明了gpgv不同变种gp6和gp18具有较大的致病力差异，对于灰比诺葡萄病毒生物学特性、致病性、致病机理、危害规律及综合防控技术的研究具有重要意义。

70、本发明为研究gpgv不同变种与症状发生的关系，通过pcr扩增获得了两个变异较大的gpgv分离物gp6和gp18的基因组全长序列。同时，为进一步研究两个差异变种的生物学特性和致病性，通过人工构建病毒的侵染性克隆方法快速获得gpgv分离物gp6和gp18的侵染性全长cdna克隆，该侵染性全长cdna克隆是分别将两个灰比诺葡萄病毒变种gp16和gp18的基因组全长片段通过无缝克隆方式，连接至含35s启动子的双元载体而获得的重组表达载体。接下来，又通过冻融法将重组表达载体转入农杆菌eha105感受态细胞，并通过农杆菌接种西方烟和葡萄验证其侵染性，最终成功获得两个序列差异较大的gpgv变种gp6和gp18的侵染性克隆。通过实验证明：本发明构建的gpgv侵染性克隆gp6和gp18能够在农杆菌eha105菌株中稳定、高效表达，并能成功侵染西方烟草和葡萄寄主，且在寄主上具有明显的致病力差异，这不仅使得gpgv的研究易于在dna水平上操作，更为后续开展gpgv的生物学特性和致病性研究提供有力的工具和重要支撑。