山葡萄抗病基因VaWRKY14及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种山葡萄抗病基因vawrky14及其其在调控灰霉病抗性中的应用。

背景技术：

1、葡萄(vitis)是世界四大水果之一，据oiv统计，2021年我国葡萄种植面积达到78.3公顷，居世界第三位，葡萄在我国农业产业和区域经济发展中占有十分重要的地位。灰霉病(botrytis cinerea)是严重危害葡萄产业的一种真菌病害，全球每年由灰霉病导致20％～40％葡萄减产，严重的可达60％以上，并随着设施栽培的广泛应用而日趋严重。目前灰霉病主要通过化学农药和生物防治来控制，但效果不佳，不仅增加葡萄栽培管理成本、污染环境，而且严重影响葡萄产品质量。国内外研究和育种实践证明，利用植物自身抗病基因，培育优质抗病葡萄新品种是长期有效安全控制葡萄真菌病害的重要措施之一。

2、wrky转录因子是高等植物特有的锌指型转录调节因子，其家族成员是调控许多植物生物胁迫、非生物胁迫以及生长发育进程的信号网络的组成部分。近年来，wrky转录因子在植物响应灰霉菌反应中的作用逐渐受到关注。然而，wrky转录因子基因在植物抗灰霉病特别是葡萄抗灰霉病中是否发挥关键作用尚有待研究。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种山葡萄抗病基因vawrky14及在其调控灰霉病抗性中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、本发明第一方面，提供一种山葡萄抗病基因vawrky14，所述基因vawrky14的dna序列如seq id no.1所示。

4、本发明第二方面，提供一种所述基因vawrky14编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqid no.2所示。

5、本发明第三方面，提供一种包含上述基因vawrky14的重组载体。

6、优选地，所述重组载体为农杆菌过表达载体。

7、本发明第四方面，提供一种扩增所述基因vawrky14的引物，所述引物序列为：

8、vawrky14-sak-f：

9、atccaaagaattccccggtaccatggcatcgggggattactcgcagg；

10、vawrky14-sak-r:

11、catgatctttgtaatcctcgagttaataaaaaggagggtgagaagaa。

12、本发明第五方面，提供一种所述基因vawrky14亚细胞定位方法，具体为：

13、设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增基因vawrky14的cds序列，利用同源重组方法将基因vawrky14整合到亚细胞定位载体pcambia2300-35s-gfp上，构建pcambia2300-35s-vawrky14-gfp重组质粒，通过热激法转化至gv3101农杆菌。引物序列如下：

14、vawrky14-2300-gfp-f：

15、acgggggacgagctcggtaccatggcatcgggggattactcgcagg；

16、vawrky14-2300-gfp-r：

17、ggtgtcgactctagaggatccataaaaaggagggtgagaagaagtt。

18、本发明第六方面，提供一种vawrky14基因过表达载体的构建方法，具体为：

19、设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增vawrky14基因的cds序列，利用同源重组方法将vawrky14基因整合到过表达载体psak277上，构建psak277-vawrky14重组质粒，通过热激法转化至gv3101农杆菌。引物序列如下：

20、vawrky14-sak-f：

21、atccaaagaattccccggtaccatggcatcgggggattactcgcagg；

22、vawrky14-sak-r:

23、catgatctttgtaatcctcgagttaataaaaaggagggtgagaagaa。

24、本发明第七方面，提供一种所述基因vawrky14或所述的蛋白质在提高植物灰霉病抗性中的应用。

25、优选地，所述基因vawrky14或者所述蛋白质用于缓解活性氧爆发程度、提高抗氧化能力或激活抗病相关基因表达。

26、本发明第八方面，提供一种灰霉病抗性提高的植株的培育方法，是促进所述基因vawrky14的表达来实现。

27、优选地，灰霉病抗性提高的植株的培育方法具体包括以下步骤：

28、构建含有所述基因vawrky14的过表达载体；

29、将含有所述基因vawrky14的过表达载体转化至感受态细胞，培养后接种至植株上，获得抗灰霉病的植物株系。

30、优选地，所述植株为烟草或山葡萄。

31、本发明通过在烟草中异源过表达和在葡萄叶片中瞬时过表达vawrky14验证了该基因的功能，经过研究发现，该基因能够提高葡萄对灰霉病的抗性，具体表现为：葡萄叶片感病面积降低，h2o2和o2.-的产生和积累增多，cat、pod和aao酶活性升高，防御相关基因如ntpod、ntpal、ntpdf1.2和ntpr1a/b更早更强烈地被激活。

32、本发明的优点：

33、本发明公开了一种基因vawrky14及其在调控灰霉病抗性的应用，分析了该基因在不同抗性葡萄材料中被灰霉菌诱导后的表达模式，利用异源过表达和瞬时过表达验证vawrky14基因在调控灰霉病抗性中的作用，发现过表达vawrky14基因的葡萄叶片与对照叶片相比，活性氧爆发程度明显缓解，抗氧化能力显著增强，抗病相关基因表达显著提高，从而降低了植株叶片坏死程度，增强了其抗灰霉病的能力。说明该基因可以调控葡萄叶片对灰霉病的抗性，对培育抗病的葡萄新品种具有积极的指导作用，有利于从分子机制上阐明山葡萄转录因子vawrky14在调控灰霉病抗性中的作用，为葡萄抗病分子育种提供理论基础和基因资源。

34、对于一些在栽培生产过程中极易遭受灰霉病侵害的葡萄品种，可以通过过表达转录因子vawrky14基因或者同源基因的方式培育一些抗病新品种。

技术特征：

1.山葡萄抗病基因vawrky14，其特征在于，所述基因vawrky14的核苷酸序列如seq idno.1所示。

2.一种权利要求1所述的基因vawrky14编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.一种包含权利要求1所述基因vawrky14的重组载体或重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为农杆菌过表达载体。

5.一种权利要求1所述的基因vawrky14或权利要求2所述的蛋白质在提高植物灰霉病抗性中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因vawrky14或者所述蛋白质用于缓解活性氧爆发程度、提高抗氧化能力或激活抗病相关基因表达。

7.一种灰霉病抗性提高的植株的培育方法，其特征在于，是促进权利要求1所述基因vawrky14的表达来实现。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该方法具体是按照以下步骤进行：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植株为烟草或山葡萄。

技术总结本发明属于生物技术领域，具体涉及一种山葡萄抗病基因VaWRKY14及其应用。本发明分析了该基因在不同抗性葡萄材料中受灰霉菌诱导后的表达模式，利用异源过表达和瞬时过表达验证VaWRKY14基因在葡萄调控灰霉病抗性中的作用，发现过表达VaWRKY14基因的葡萄叶片与对照叶片相比，活性氧爆发程度缓解、抗氧化能力增强和抗病相关基因表达提高，说明该基因可以调控葡萄灰霉病抗性，对培育抗灰霉病的葡萄新品种具有积极的指导作用。技术研发人员：万然,高敏,杨振锋,杨智淇,刘俊,郑先波,王西平受保护的技术使用者：河南农业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/29